প্রযুক্তি

PHAGE-ATAC ব্যবহার করে প্রোটিনের একক-কোষ প্রোফাইলিং এবং ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসযোগ্যতা

PHAGE-ATAC ব্যবহার করে প্রোটিনের একক-কোষ প্রোফাইলিং এবং ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসযোগ্যতা
বিমূর্তএকক-কোষ প্রোফাইলের মাল্টিমোডাল পরিমাপ কোষের অবস্থা এবং নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়ার বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের জন্য ক্রমবর্ধমানভাবে কার্যকর প্রমাণিত হচ্ছে। বর্তমান সমীক্ষায়, আমরা PHAGE-ATAC (ট্রান্সপোজেস-অ্যাক্সেসিবল ক্রোমাটিনের জন্য অ্যাস) তৈরি করেছি, একটি ব্যাপক সমান্তরাল ড্রপলেট-ভিত্তিক পদ্ধতি যা ফেজ প্রদর্শন, ইঞ্জিনিয়ারড, ক্যামেলিড একক-ডোমেন অ্যান্টিবডি ('ন্যানোবডি') একযোগে একক-কোষ পরিমাপের জন্য ব্যবহার করে। প্রোটিনের মাত্রা এবং ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটি প্রোফাইল এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ-ভিত্তিক ক্লোনাল…

বিমূর্ত

একক-কোষ প্রোফাইলের মাল্টিমোডাল পরিমাপ কোষের অবস্থা এবং নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়ার বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের জন্য ক্রমবর্ধমানভাবে কার্যকর প্রমাণিত হচ্ছে। বর্তমান সমীক্ষায়, আমরা PHAGE-ATAC (ট্রান্সপোজেস-অ্যাক্সেসিবল ক্রোমাটিনের জন্য অ্যাস) তৈরি করেছি, একটি ব্যাপক সমান্তরাল ড্রপলেট-ভিত্তিক পদ্ধতি যা ফেজ প্রদর্শন, ইঞ্জিনিয়ারড, ক্যামেলিড একক-ডোমেন অ্যান্টিবডি (‘ন্যানোবডি’) একযোগে একক-কোষ পরিমাপের জন্য ব্যবহার করে। প্রোটিনের মাত্রা এবং ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটি প্রোফাইল এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ-ভিত্তিক ক্লোনাল ট্রেসিং। আমরা প্রাথমিক মানব ইমিউন কোষে মাল্টিমোডাল বিশ্লেষণ, নমুনা মাল্টিপ্লেক্সিং, আন্তঃকোষীয় প্রোটিন বিশ্লেষণ এবং মানব কোষের জনসংখ্যায় SARS-CoV-2 স্পাইক প্রোটিন সনাক্তকরণের জন্য PHAGE-ATAC ব্যবহার করি। অবশেষে, আমরা অ্যান্টিজেন-নির্দিষ্ট ন্যানোবডি নির্বাচনের জন্য একটি সিন্থেটিক হাই-কমপ্লেক্সিটি ফেজ লাইব্রেরি তৈরি করি যা নির্দিষ্ট আণবিক প্রোফাইলের কোষগুলিকে আবদ্ধ করে, প্রোটিন সনাক্তকরণ, কোষের চরিত্রায়ন এবং একক-কোষ জিনোমিক্সের সাথে স্ক্রিনিংয়ের একটি পথ খুলে দেয়।

প্রধান

ব্যাপকভাবে সমান্তরাল একক-কোষ প্রোফাইলিং আছে তাদের ট্রান্সক্রিপ্টোম বা এপিজেনোম দ্বারা কোষের চরিত্রায়নের জন্য একটি অমূল্য হাতিয়ার হয়ে ওঠে, জিন নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়ার পাঠোদ্ধার করে এবং জটিল টিস্যুতে সেলুলার ইকোসিস্টেমগুলিকে বিচ্ছিন্ন করে 1,2,3,4। বিশেষ করে, সাম্প্রতিক অগ্রগতিগুলি মাল্টিমডাল একক-কোষ অ্যাসেসের শক্তিকে হাইলাইট করেছে5, যেমন সেলুলার ইনডেক্সিং সিকোয়েন্সিং দ্বারা ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং এপিটোপস (CITE-seq), যা ডিএনএ-বারকোডেড অ্যান্টিবডি

দ্বারা ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিন উভয়ের প্রোফাইল করে 6, 7, 8, 9,১০

। যদিও অলিগোনিউক্লিওটাইড বারকোডের বিশাল সম্মিলিত স্থান তাত্ত্বিকভাবে একটি অনিয়ন্ত্রিত সংখ্যক এপিটোপের সমান্তরাল পরিমাণ নির্ধারণের অনুমতি দেয়, বাস্তবে এই পদ্ধতিগুলি অ্যান্টিজেন-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলির প্রাপ্যতার দ্বারা সীমাবদ্ধ। অধিকন্তু, প্রতিটি অ্যান্টিবডিকে আলাদাভাবে একটি অনন্য অলিগোনিউক্লিওটাইড (অলিগো)-বারকোড দিয়ে সংযোজিত করতে হবে, যা বর্তমানে বারকোডযুক্ত অ্যান্টিবডি লাইব্রেরিগুলির একটি পরিমাপযোগ্য এবং পুল নির্মাণের অনুমতি দেয় না। এপিজেনোম এবং প্রোটিওমের সম্মিলিত উচ্চ-থ্রুপুট পরিমাপের জন্য সাম্প্রতিক প্রযুক্তি9, 10 এছাড়াও এপিটোপ সনাক্তকরণের জন্য অলিগো-বারকোডযুক্ত অ্যান্টিবডি প্যানেলের উপর নির্ভর করে এবং এইভাবে প্রোটিন সনাক্তকরণকে স্কেল করার জন্য রূপরেখাযুক্ত চ্যালেঞ্জগুলির মুখোমুখি হয়।

বর্তমান গবেষণায়, আমরা PHAGE-ATAC বর্ণনা করি (চিত্র। 1a–c এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র। 1a,b), ফোঁটা-ভিত্তিক মাল্টিপ্লেক্স প্রোটিন পরিমাপের জন্য একটি মাল্টিমোডাল একক-কোষ পদ্ধতি এবং ড্রপলেট-ভিত্তিক একক-কোষ (sc) ATAC-সিকোয়েন্সিং (10× জিনোমিক্স scATAC) ব্যবহার করে ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটি প্রোফাইলিং 4 )। PHAGE-ATAC অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন এবং প্রোটিনগুলির সংবেদনশীল পরিমাণ নির্ধারণ করতে সক্ষম করে, মাইটোকন্ড্রিয়াল (এমটি) ডিএনএ ক্যাপচার করে যা একটি নেটিভ ক্লোনাল ট্রেসার হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে ১১,12, উচ্চ-থ্রুপুট, একক-কোষ এপিটোপ প্রোফাইলিংয়ের জন্য পুনর্নবীকরণযোগ্য বিকারক হিসাবে ফেজগুলিকে প্রবর্তন করে এবং অ্যান্টিজেন-নির্দিষ্ট নির্বাচনের জন্য ফেজ লাইব্রেরিগুলির সুবিধা দেয় অ্যান্টিবডি13,14 সামগ্রিকভাবে, PHAGE-ATAC একটি পদ্ধতি প্রদান করে যা একক-কোষ প্রোফাইলিং টুলবক্সের সুযোগকে প্রসারিত করবে।

চিত্র. 1: PHAGE-ATAC প্রোটিন এপিটোপ এবং ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটির ব্যাপক সমান্তরাল সমসাময়িক সনাক্তকরণের জন্য।

ac, PHAGE-ATAC ওভারভিউ। a, প্রকৌশলী Nb-এর পরিকল্পিত PHAGE-ATAC-এর জন্য ব্যবহৃত M13 ফেজ প্রদর্শন করা হচ্ছে। এনবিএস ফিউশনের মাধ্যমে p3 কোট প্রোটিনে প্রদর্শিত হয়; PAC ট্যাগ Nb এবং p3 এর মধ্যে লিঙ্কারে স্থাপন করা হয়। M13 ফেজমিডগুলিতে পেরিপ্লাজমিক নিঃসরণ এবং ফেজ সমাবেশের সময় ফিউশনগুলি অন্তর্ভুক্ত করার জন্য একটি pelB নেতা থাকে। b

, PAC- ট্যাগ RD1 ক্রম (গোলাপী) 10× ATAC জেল পুঁতি অলিগোস দ্বারা ক্যাপচার করতে দেয় (বর্ধিত ডেটা চিত্র 1c ), খোলা পড়ার ফ্রেম ব্যাহত না করে। c
, PHAGE-ATAC কর্মপ্রবাহ। ফেজ এনবি স্টেনিং, ফিক্সেশন, লাইসিস এবং ট্যাগমেন্টেশনের পর বাল্ক (বামে), একক কোষ এবং 10× ATAC জেল পুঁতিগুলিকে 10× জিনোমিক্স মাইক্রোফ্লুইডিক্স ব্যবহার করে ফোঁটাগুলিতে আবদ্ধ করা হয়, তারপরে ক্রোমাটিনফ্রিজাইজেশনের যুগপত ফোঁটা বারকোডিংয়ের সাথে রৈখিক পরিবর্ধন দ্বারা অনুসরণ করা হয়। 10× বারকোডিং প্রাইমার থেকে RD1 সিকোয়েন্স (মাঝখানে)। পৃথক PDT এবং ATAC-seq লাইব্রেরি প্রস্তুত করা হয়েছে (ডান এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 1f))। ডানদিকে: প্রতিনিধি বায়োঅ্যানালাইজার ট্রেস। বিসি, গুটিকা বারকোড; FU, ফ্লুরোসেন্স ইউনিট। d–k, একক-কোষ ATAC-seq এবং EGFP নির্দিষ্টতা একটি প্রজাতির মিশ্রণ পরীক্ষা. d
, পরীক্ষামূলক স্কিম। e
, মানুষের সংখ্যা (

এক্স অক্ষ) এবং মাউস y অক্ষ) প্রতিটি পুঁতির বারকোডের সাথে যুক্ত ATAC টুকরা (বিন্দু), মানব ইজিএফপি হিসাবে অ্যাসাইনমেন্ট দ্বারা রঙিন )+ (হালকা নীল), মানুষের EGFP (গাঢ় নীল), মাউস (লাল), ডাবলট (বেগুনি,>10% মানুষ এবং মাউসের টুকরো)। f, EGFP PDT গণনা (y অক্ষ, লগ

10

স্কেল) এবং ATAC খণ্ডের সংখ্যা এক্স অক্ষ, লগ

10

স্কেল) প্রতিটি পুঁতির জন্য বারকোড (বিন্দু) রঙিন (রঙের কিংবদন্তি দেখুন)। g,ঘঃ, EGFP PDTs বিতরণ g, y অক্ষ) এবং ATAC টুকরো ঘ, y

অক্ষ) তিনটি জনসংখ্যার প্রতিটিতে এক্স

অক্ষ, মানুষের EGFP+ কোষ, n

=580; মানুষের EGFP− কোষ, n

=578; মাউস কোষ, n=একটি পরীক্ষা থেকে 1,212; এক-লেজ মান–হুইটনি উ-পরীক্ষা, P −4))। NS, উল্লেখযোগ্য নয়। ভিতরে g মানব ইজিএফপি+ বনাম মানব ইজিএফপি

−, P=5.039 × 10 −191; মানুষের EGFP বনাম মাউস, P=2.946 × 10−10; মানুষের EGFP+ বনাম মাউস, P=1.101 × 10−257। রেখাটি মধ্যমা। i–k, ফ্লো সাইটোমেট্রির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ পিডিটি পরিমাপ। EGFP ফ্লুরোসেন্স (i, y অক্ষ) এবং বিতরণ j, এক্স অক্ষ) এবং EGFP PDT এর বিতরণ k, এক্স অক্ষ) EGFP+ (হালকা নীল) এবং EGFP (গাঢ় নীল) মানুষের কোষ।

দ্বারা এপিটোপ স্বীকৃতির উপর ভিত্তি করে 15-ফেজ প্রদর্শন করা (চিত্র। 1a এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র। 1a,b), CITE-seq এবং সম্পর্কিত পদ্ধতিতে অলিগোনিউক্লিওটাইড-কনজুগেটেড অ্যান্টিবডি দ্বারা স্বীকৃতির বিপরীতে 7,8, অথবা অন্যান্য কৌশলে ফ্লুরোসেন্টলি লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি16, 17। প্রতিটি এনবি-এনকোডিং ফাগেমিডের মধ্যে হাইপারভেরিয়েবল কমপ্লিমেন্টারিটি-নির্ধারক অঞ্চল 3 (সিডিআর3) একটি অনন্য জেনেটিক বারকোড

হিসেবে কাজ করে 18

যা শনাক্ত করা হয়েছে PHAGE-ATAC-তে সিকোয়েন্সিং করে, এবং অ্যান্টিজেন সনাক্তকরণ এবং পরিমাণ নির্ধারণের জন্য একটি প্রক্সি হিসাবে কাজ করে (চিত্র 1a এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র। 1a)। অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন প্রোফাইলিংয়ের পাশাপাশি ফেজ-ভিত্তিক এপিটোপ পরিমাণ নির্ধারণের অনুমতি দেওয়ার জন্য, আমরা ফ্রেমের মধ্যে অভিব্যক্তির জন্য একটি M13 ফেজমিড তৈরি করেছি: (1) একটি এপিটোপ-বাইন্ডিং Nb; (2) একটি PHAGE-ATAC ট্যাগ (PAC-tag) যাতে ইলুমিনা রিড 1 সিকোয়েন্স (RD1); এবং (3) পৃষ্ঠ প্রদর্শনের জন্য ফেজ কোট প্রোটিন p3 (চিত্র 1a,b))। এটি কোষ-পৃষ্ঠের অ্যান্টিজেনগুলির ফেজ (পি) এনবি-ভিত্তিক স্বীকৃতি, ফেজমিড এবং এটিএসি টুকরোগুলির একযোগে সূচীকরণ এবং সেইসাথে ফেজ-ডিরাইভড ট্যাগ (পিডিটি) এবং এটিএসি-সিক লাইব্রেরিগুলির পৃথক প্রজন্ম (চিত্র

সক্ষম করে 1c এবং এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র। 1c–f; পদ্ধতি).

আমরা প্রথমে যাচাই করেছিলাম যে PHAGE-ATAC-সংশোধিত phagemid ওয়ার্কফ্লো নির্দিষ্ট pNb অ্যান্টিজেন স্বীকৃতি এবং pNb-ভিত্তিক সেল স্টেনিং করার অনুমতি দেয় scATAC সেল লাইসিসের সময়। ধারণার প্রমাণ হিসাবে, আমরা HEK293T কোষ ব্যবহার করেছি যা পৃষ্ঠ-উন্মুক্ত, গ্লাইকোসিলফসফ্যাটিডিল-ইনোসিটল (জিপিআই)-অ্যাঙ্করড, বর্ধিত সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (ইজিএফপি) (ইজিএফপি-জিপিআই) প্রকাশ করে যা একটি অ্যান্টি-EGFP pNb

দ্বারা বিশেষভাবে স্বীকৃত। 19 (বর্ধিত ডেটা চিত্র। 2a -e)। উল্লেখযোগ্যভাবে, PAC- ট্যাগের প্রবর্তন Nb ডিসপ্লে এবং অ্যান্টিজেন সনাক্তকরণকে ক্ষতিগ্রস্ত করেনি (বর্ধিত ডেটা চিত্র 2f,g)। অধিকন্তু, ফিক্সেশন লাইসিস ধাপের পরে পিএনবি-ভিত্তিক সেল স্টেনিং ধরে রাখে (বর্ধিত ডেটা চিত্র। 2 ঘন্টা,i এবং দেখো পদ্ধতি ). প্রোটিন এবং অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিনের ফেজ-ভিত্তিক একক-কোষ প্রোফাইলিং

একক-কোষ প্রোফাইলিংয়ের জন্য বেঞ্চমার্ক PHAGE-ATAC করার জন্য, আমরা একটি ‘প্রজাতি-মিশ্রণ’ পরীক্ষা করেছি, যেখানে আমরা মাউস (NIH3T3), মানব ইজিএফপি (HEK293T) এবং মানুষের EGFP+ (HEK293T-EGFP-GPI) সেল 2:1:1 অনুপাতে, তারপরে একটি কাস্টমাইজড কম্পিউটেশনাল ওয়ার্কফ্লো ব্যবহার করে অ্যান্টি-EGFP pNb স্টেনিং, লাইব্রেরি প্রস্তুতি এবং বিশ্লেষণ (চিত্র 1d এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র।

3a

; পদ্ধতি)। ফিল্টার করার পরে, আমরা 1,212টি মাউস এবং 1,158টি মানব কোষের বারকোড উদ্ধার করেছি (চিত্র 1e), উচ্চ গড় ট্রান্সক্রিপশন স্টার্ট সাইট (TSS) সমৃদ্ধকরণ স্কোর (8.3), চূড়ায় খণ্ডের ভগ্নাংশ (54.7%), DNase-অতি সংবেদনশীল সাইট (64.6%) এবং TSSs (36.8%) (বর্ধিত ডেটা চিত্র। 3b–d এবং পরিপূরক সারণী 6), গোল্ড-স্ট্যান্ডার্ডের সাথে তুলনীয়, অতিরিক্ত প্রোটিন সনাক্তকরণ ছাড়াই প্রকাশিত রেফারেন্স ডেটা

4, 11 . EGFP PDT গণনার বিশ্লেষণ EGFP+ এর উপস্থিতি নিশ্চিত করেছে এবং EGFP কোষ (চিত্র

1f,g

) যা একসাথে মাউস সেল বারকোড সহ, প্রত্যাশিত ইনপুট অনুপাত (2.09:1:1, প্রত্যাশিত 2:1:1) এ পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল, scATAC-seq ডেটা গুণমানের মেট্রিক্সে কোন অর্থপূর্ণ পার্থক্য নেই (চিত্র

1h এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র।

3b–d)। PHAGE-ATAC দ্বারা EGFP PDT মাত্রা (চিত্র 1f,g) এবং স্ট্যান্ডার্ড ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা EGFP ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা (চিত্র 1i) ছিল অত্যন্ত সঙ্গতিপূর্ণ (ফ্লো সাইটোমেট্রি EGFP 49.3% বনাম PHAGE-ATAC EGFP 50.4% এবং ফ্লো সাইটোমেট্রি EGFP+ 50.7% বনাম PHAGE-ATAC EGFP+ 49.6%) (চিত্র 1j,k).

যেহেতু PHAGE-ATAC ড্রপলেট এনক্যাপসুলেশন এবং বারকোডিংয়ের আগে সেলের অভ্যন্তরে অ্যাক্সেস সক্ষম করে ( পদ্ধতি), আমরা যুক্তি দিয়েছিলাম যে সেল লাইসিসের পরে পিএনবি দাগ হতে পারে অন্তঃকোষীয় অ্যান্টিজেনগুলির একক-কোষ সনাক্তকরণের অনুমতি দেয়। PHAGE-ATAC পদ্ধতি), আমরা সাইটোসোলিক EGFP প্রকাশ করে HEK293T কোষ বিশ্লেষণ করেছি, একটি অ্যান্টিজেন যা অক্ষত কোষগুলিতে pNb দাগের জন্য অ্যাক্সেসযোগ্য নয় (বর্ধিত ডেটা চিত্র।

2d)। যদিও EGFP এর সাথে ফেজ বাইন্ডিং অক্ষত কোষগুলিতে সনাক্তযোগ্য ছিল না, সেখানে শক্তিশালী অ্যান্টি-EGFP pNb স্টেনিং পোস্টফিক্সেশন এবং লাইসিস ছিল (বর্ধিত ডেটা চিত্র। 3e) এবং EGFP PDTs প্রত্যাশিত অনুপাতে বিশ্বস্ত বিমোডাল সাইটোসোলিক EGFP ফ্লুরোসেন্স দেখিয়েছে (বর্ধিত ডেটা চিত্র

3f)। এইভাবে, PDTs নির্ভুলভাবে এবং সংবেদনশীলভাবে এক্সট্রা সেলুলার বা ইন্ট্রাসেলুলার এপিটোপগুলি পরিমাপ করতে পারে।

প্রোটিন, ক্রোমাটিন এবং এমটিডিএনএ জিনোটাইপ পরিমাপের জন্য ফেজ-এটিএসি

PHAGE-ATAC দ্বারা সনাক্তযোগ্য এপিটোপের সংখ্যা আরও প্রসারিত করতে, আমরা PHAGE-ATAC এর সাথে প্রবর্তন করেছি অ্যান্টিজেন প্রোফাইলিং নির্বাচন করুন (PHAGE-ASAP), pNbs এবং অলিগো-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি (বাণিজ্যিক টোটালসেক অ্যান্টিবডি) (চিত্র। 2a

; পদ্ধতি), এবং ফেজ স্টেনিংকে আরও ভালভাবে সংরক্ষণ করতে PHAGE-ATAC লাইসিস বাফারটিকে আরও অপ্টিমাইজ করেছে 11 (বর্ধিত দা ta চিত্র। 4; পদ্ধতি)।

figure2চিত্র. 2: এপিটোপের জন্য PHAGE-ATAC এবং PHAGE-ASAP-এর বেঞ্চমার্কিং, অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন প্রোফাইলিং এবং এমটিডিএনএ জিনোটাইপ ক্যাপচার বনাম ASAP-seq এবং CITE-seq.

a

, মাল্টিমোডাল কর্মপ্রবাহের তুলনা। b, তুলনীয় TSS সমৃদ্ধকরণ . গড় আপেক্ষিক সমৃদ্ধি y

অক্ষ) ATAC খণ্ডগুলির TSSs এক্স অক্ষ) প্রতিটি পদ্ধতির জন্য। c, তুলনীয় কোষের ধরন এবং প্রোটিন assays জুড়ে সনাক্তকরণ. scRNA-seq প্রোফাইলের 2D যৌথ এম্বেডিং প্রকাশিত CITE-seq8 এবং PHAGE-ATAC, ASAP-seq এবং PHAGE-ASAP থেকে scATAC-seq প্রোফাইল, টীকাযুক্ত কোষের প্রকার (শীর্ষ) বা প্রোটিন মার্কার ADTs বা PDTs (নীচে) স্তর দ্বারা রঙিন।

d, প্রোটিন স্তর অনুমানের মধ্যে চুক্তি (PDT বা ADT) বিভিন্ন অ্যাসেস থেকে। পিয়ারসনের আর (রঙ) নির্দেশিত ADTs বা PDTs (কলাম এবং সারি) এর প্রতিটি জোড়ার জন্য দেওয়া হয়। e, তুলনীয় সেল-টাইপ শ্রেণীবিভাগ assays জুড়ে নির্ভুলতা. শ্রেণিবিন্যাস নির্ভুলতা (AUROC, y অক্ষ) CD4+ (বামে) বা CD8+ (ডানদিকে) ) টি কোষ প্রতিটি পরীক্ষায় পরিমাপিত CD4 এবং CD8 প্রোটিন ট্যাগ স্তরের (ADT বা PDT) উপর ভিত্তি করে। f

, বিভিন্ন ডেটা প্রোফাইল সনাক্ত করেছে ফেজ-শীঘ্রই। 2D এম্বেডিং যা PHAGE-ASAP scATAC-seq প্রোফাইলগুলি দেখায় (যেমন c), প্রোটিন মার্কার ADTs বা PDTs (বাম), স্বাভাবিককৃত জিন কার্যকলাপ স্কোর (মধ্যম) বা mtDNA মিউটেশন ফ্রিকোয়েন্সি (ডান) দ্বারা রঙিন। g, প্রোটিন স্তর অনুমানের মধ্যে চুক্তি (PDT বা ADT) সমস্ত সেল স্টেট জুড়ে প্রতিটি মার্কারের জন্য PHAGE-ASAP থেকে। পিয়ারসনের আর (রঙ) নির্দেশিত ADTs বা PDTs (কলাম এবং সারি) এর প্রতিটি জোড়ার জন্য দেওয়া হয়।

পরবর্তীতে, আমরা দেখিয়েছি যে PHAGE-ATAC (এবং PHAGE-ASAP) একই সাথে অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন, পৃষ্ঠের এপিটোপ এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনোটাইপ পরিমাপ করতে পারে ১১, 12 পেরিফেরাল রক্তের মনোনিউক্লিয়ার কোষে ( PBMCs), অলিগো-বারকোডযুক্ত অ্যান্টিবডির সাথে তুলনীয় মানের সাথে CITE-seq এবং ASAP-seq 9

(চিত্র 2a)। আমরা চারটি pNbs ব্যবহার করেছি: CD4, CD8 এবং CD16 এর বিরুদ্ধে তিনটি পূর্বে রিপোর্ট করা হাই-অ্যাফিনিটি Nb সিকোয়েন্স এবং একটি নির্বাচিত অ্যান্টি-CEACAM4 Nb (প্রসারিত করুন ed ডেটা চিত্র। 5a–d এবং পদ্ধতি)। PHAGE-ASAP-এর জন্য, আমরা পাঁচটি TotalSeq অ্যান্টিবডিও অন্তর্ভুক্ত করেছি (CD4, CD3, CD14, CD11c এবং CD19)। pNb-দাগযুক্ত PBMC-এর ফ্লো সাইটোমেট্রি এবং pNbs এবং প্রচলিত অ্যান্টিবডি-দাগযুক্ত কোষগুলির মধ্যে পাশাপাশি তুলনা উত্পাদিত ফেজগুলির অ্যান্টিজেন নির্দিষ্টতা নিশ্চিত করেছে (বর্ধিত ডেটা চিত্র 5e)। PHAGE-ATAC, ASAP-seq এবং PHAGE-ASAP-এর তুলনামূলক ডেটা গুণমান ছিল (চিত্র

2b, বর্ধিত ডেটা চিত্র 6a–c এবং পরিপূরক সারণী 6)। ইন্টিগ্রেটিভ ক্যানোনিকাল পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ20, PHAGE-ATAC, ASAP-seq, PHAGE-ASAP এবং প্রকাশিত CITE-seq ডেটা

এর ক্লাস্টারিং এবং মাত্রা হ্রাস 8 প্রত্যাশিত কোষ অবস্থার একই সেট সনাক্ত করেছে (চিত্র 2c; পদ্ধতি)। PDT (PHAGE-ATAC এবং PHAGE-ASAP থেকে) এবং অ্যান্টিবডি থেকে প্রাপ্ত ট্যাগ (ADT, ASAP-seq এবং CITE-seq থেকে) প্রতিটি সেল-সারফেস চিহ্নিতকারীর মানগুলি অত্যন্ত পারস্পরিক সম্পর্কযুক্ত ছিল (পিয়ারসনের

r=০.৮৯–০.৯৯ ; চিত্র। 2d ), এবং CD4 এবং CD8 PDT কোষ জুড়ে প্রত্যাশিত কোষের জনসংখ্যা প্রতিফলিত করে (বর্ধিত ডেটা চিত্র 6d,e)। CD4 এবং CD8 PDT প্রাচুর্য থেকে ডিফারেনশিয়াল জিন কার্যকলাপ স্কোর (বর্ধিত ডেটা চিত্র 6f) চিহ্নিত CD4 এবং CD8 শীর্ষ হিট হিসাবে loci এবং অনেক পরিচিত সত্যনিষ্ঠ মার্কার পুনরুদ্ধার CD4+ এবং CD8+ টি কোষ (উদাহরণস্বরূপ, CD4:

CD40LG

, ANKRD55

, TSHZ2

; CD8: PRF1, ইওমস

, RUNX3; বর্ধিত ডেটা চিত্র। 6f)। অবশেষে, CD4+ এবং CD8+ টি কোষগুলিকে একা CD4 এবং CD8 PDT স্তর দ্বারা সঠিকভাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল (রিসিভারের অধীনে এলাকা অপারেটিং বৈশিষ্ট্য (AUROC)=0.85–0.89) (চিত্র 2e এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র। 6g; পদ্ধতি)। PHAGE-ASAP সফলভাবে PDTs, ADTs, অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনোটাইপ ক্যাপচার করেছে 11 (mtDNA থেকে প্রাপ্ত খণ্ডের মধ্য ভগ্নাংশ=22.1–23.0%) (চিত্র 2f এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 6h–j; পদ্ধতি ), এন্টি-CD4 pNb এবং এন্টি-CD4 টোটালসেক অ্যান্টিবডি সংকেতের মধ্যে উচ্চ সমন্বয় সহ কোষের রাজ্য জুড়ে (পিয়ারসনের r

=০.৯৯; চিত্র 2g)। এইভাবে, PHAGE-ATAC নির্ভরযোগ্যভাবে এবং বিশেষভাবে সেল-সারফেস প্রোটিন, এপিজেনোমিক প্রোফাইল এবং একক কোষে mtDNA জিনোটাইপ সনাক্ত করে।ফেজ Nbs সেল হ্যাশিং এবং নমুনা মাল্টিপ্লেক্সিং সক্ষম করে PHAGE-ATAC স্কেল করার জন্য, আমরা সেল হ্যাশিংয়ের জন্য pNbs ব্যবহার করে scATAC-seq-এ নমুনা মাল্টিপ্লেক্সিংয়ের একটি বিকল্প চালু করেছি। বেশ কিছু পদ্ধতি অ্যান্টিবডি-ট্যাগযুক্ত কোষগুলিকে ড্রপলেটগুলিতে থ্রুপুট বাড়াতে এবং ব্যাচের প্রভাবগুলি হ্রাস করার অনুমতি দেয় 2,

21, figure322,২৩ । PHAGE-ATAC-এর জন্য হ্যাশট্যাগগুলি প্রদর্শন করতে, আমরা চারটি অ্যান্টি-CD8 হ্যাশট্যাগ pNbs (এখন থেকে হ্যাশট্যাগ হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে) তৈরি করেছি অ্যান্টি-CD8 CDR3 (চিত্র এ স্বতন্ত্র নীরব মিউটেশন প্রবর্তন করে 3a; পদ্ধতি), সিকোয়েন্সিং-ভিত্তিক অনুমতি দেয় প্রতিটি হ্যাশট্যাগের সনাক্তকরণ। প্রত্যাশিত হিসাবে, হ্যাশট্যাগগুলি PBMC-এর মধ্যে তুলনীয় CD8 স্বীকৃতি প্রদর্শন করেছে (বর্ধিত ডেটা চিত্র 7a)। ফেজ-ভিত্তিক হ্যাশিং প্রদর্শনের জন্য, আমরা চারটি ভিন্ন স্বাস্থ্যকর দাতাদের থেকে CD8 T কোষগুলিকে একটি অনন্য হ্যাশট্যাগ দিয়ে দাগ দিয়েছি, তাদের পুল করেছি এবং PHAGE-ATAC ওভারলোডিং 20,000 কোষ দ্বারা পুলটি প্রক্রিয়া করেছি (চিত্র

3a) (ওভারলোডিং ছাড়াই ~6,000 সেলের বিপরীতে)। এইগুলি 8,366টি সেল বারকোডের জন্য উচ্চ-মানের ডেটা দিয়েছে যার জন্য আমরা হ্যাশট্যাগ গণনা থেকে দাতা এবং একক/ডবল স্ট্যাটাস বরাদ্দ করেছি পদ্ধতি), 6,438 সিঙ্গেল এবং 703 ডাবলটের জন্য উৎপত্তির নমুনা শনাক্ত করা (পর্যবেক্ষিত ডাবলের হার 8.4% বনাম 10% প্রত্যাশিত) (চিত্র

3b,c

)। সিঙ্গলেট এবং ডাবল অ্যাসাইনমেন্ট হ্যাশট্যাগ গণনা ডেটার দ্বি-মাত্রিক (2D) এম্বেডিংয়ের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ ছিল (চিত্র figure33d), প্রত্যাশিত উচ্চ সংখ্যক ক্রোমাটিন টুকরা সহ এবং হ্যাশট্যাগ ডবলে P −16, মান–হুইটনি উ-পরীক্ষা; চিত্র

3e,f)। হ্যাশট্যাগ-ভিত্তিক অ্যাসাইনমেন্টগুলি অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন প্রোফাইল থেকে গণনামূলকভাবে প্রাপ্ত দাতা জিনোটাইপগুলির উপর ভিত্তি করে অ্যাসাইনমেন্টগুলির সাথে অত্যন্ত সঙ্গতিপূর্ণ ছিল 24 পদ্ধতি ), 99.3% এর একক শ্রেণীবিন্যাস নির্ভুলতা এবং 92.9% এর সামগ্রিক শ্রেণীবিভাগ নির্ভুলতা সহ (চিত্র

3g)। উল্লেখযোগ্যভাবে, ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটি বিশ্লেষণগুলি পুটেটিভ বি কোষগুলির একটি ছোট সেট প্রকাশ করেছে (বর্ধিত ডেটা চিত্র। figure37b,c), একটি ছোটখাটো দূষিত জনসংখ্যার উপস্থিতির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ CD8 টি-সেল সমৃদ্ধকরণের পরে। যদিও বি কোষগুলিকে হ্যাশট্যাগ নেতিবাচক হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল, জিনোটাইপ- এবং হ্যাশট্যাগ-ভিত্তিক শ্রেণিবিন্যাসগুলি CD8 টি-সেল রাজ্যগুলিতে অত্যন্ত সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল (চিত্র 3h এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র figure37d–f), আরও নিশ্চিত করে হ্যাশট্যাগ অ্যান্টিজেন নির্দিষ্টতা। mgatk ব্যবহার করে মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনোটাইপিং

11

হ্যাশট্যাগ অ্যাসাইনমেন্টের সাথে বিস্তৃতভাবে সঙ্গতিপূর্ণ ছিল, কিন্তু দেখায় যে দুইজন দাতা (PH-B এবং PH-C) একই হ্যাপ্লোটাইপ ভাগ করে নিয়েছে, যেখানে অন্য দুই দাতাদের প্রত্যেকের আলাদা আলাদা রূপ রয়েছে (বর্ধিত ডেটা চিত্র। 7g)। সমষ্টিগতভাবে, এই ফলাফলগুলি scATAC-seq-এ নমুনা মাল্টিপ্লেক্সিংয়ের জন্য হ্যাশট্যাগ pNbs-এর ব্যবহার প্রতিষ্ঠা করে।

চিত্র. 3: নীরব মিউটেশনগুলিকে আশ্রয় করে ফেজ ন্যানোবডিগুলি নমুনা মাল্টিপ্লেক্সিং সক্ষম করে৷
figure1

a, নীরব মিউটেশনের মাধ্যমে ফেজ হ্যাশট্যাগ তৈরি করা। স্কিম্যাটিক চারটি অ্যান্টি-CD8 ফেজ হ্যাশট্যাগ এবং চারটি মানব দাতা থেকে CD8 T কোষ ব্যবহার করে পরবর্তী হ্যাশিং পরীক্ষা দেখায়। b–ঘঃ, ফেজ হ্যাশট্যাগের কার্যকরী ডিমাল্টিপ্লেক্সিং। b, PDT গণনা (রঙ বার , CLR) প্রতিটি হ্যাশট্যাগ (সারি) জুড়ে সেল (কলাম) জুড়ে তাদের HTODemux শ্রেণিবিন্যাস (ফেজ হ্যাশ আইডি) দ্বারা সাজানো। c, প্রতিটির জন্য PDT গণনা বিতরণ হ্যাশট্যাগ (রঙিন হিস্টোগ্রাম) চারটি ফেজ হ্যাশ আইডি জুড়ে (উইলকক্সনের টু-টেইল্ড টেস্ট, P −4

)। d

, ঘরের 2D এম্বেডিং বি। এ PDT গণনা ডেটা দ্বারা rcodes, চিহ্নিত হ্যাশট্যাগের জন্য PDT গণনা দ্বারা রঙিন (চারটি বাম প্যানেল) বা একক/ডবল শ্রেণীবিভাগ দ্বারা (ডানদিকে)। e, f, বারকোড প্রতি ATAC খণ্ডের সংখ্যা বিতরণ ( e, y

অক্ষ) বা PDT গণনা f,

y অক্ষ) প্রতিটি বিভাগে সেল বারকোডে এক্স অক্ষ) (দুই লেজযুক্ত মান–হুইটনি উ-পরীক্ষা, P −4)। NS, উল্লেখযোগ্য নয়। রেখাটি মধ্যমা। g

, সংখ্যা এবং শতাংশ (রঙ) ). শীর্ষ: সামগ্রিক নির্ভুলতা। h, প্রতিটি কোষের অনুপাত টাইপ (

y অক্ষ) প্রতিটি নির্ধারিত বারকোড বিভাগের মধ্যে এক্স অক্ষ) জিনোটাইপ (বাম) এবং/অথবা হ্যাশট্যাগের উপর ভিত্তি করে (ডান), এবং নেতিবাচক ভগ্নাংশে (অনেক ডানে)।

একক কোষ প্রোটিনের জন্য pNbs এর ফেজ ডিসপ্লে নির্বাচন প্রোফাইলিং

উচ্চ মানের অ্যান্টিজেন-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলির উত্পাদন শ্রমসাধ্য, ব্যয়বহুল এবং পশুর প্রতিষেধক দ্বারা সীমিত, অ্যান্টিবডি-ভিত্তিক প্রোটিন প্রোফাইলিংয়ের জন্য একটি বাধা তৈরি করে 25। বিপরীতে, ফেজ ডিসপ্লের উপর ভিত্তি করে রিকম্বিন্যান্ট অ্যান্টিবডি প্রযুক্তি উত্পাদিত বিশুদ্ধ লক্ষ্যগুলির বিরুদ্ধে উচ্চ-সম্পর্কের বাইন্ডারগুলির দ্রুত নির্বাচনের অনুমতি দিয়েছে, উদাহরণস্বরূপ, ব্যাকটেরিয়া বা পোকামাকড়ের হোস্টে বা এমনকি সম্পূর্ণ অক্ষত স্তন্যপায়ী কোষগুলিতে প্রকাশিত অ্যান্টিজেনের বিরুদ্ধে

figure414,figure426। মাত্র কয়েক সপ্তাহের মধ্যে PHAGE-ATAC-এর জন্য অ্যান্টিজেন-নির্দিষ্ট pNbs-এর দ্রুত উৎপাদন সক্ষম করার জন্য, আমরা একটি PHAGE-ATAC ন্যানোবডি লাইব্রেরি (PANL), একটি সিন্থেটিক উচ্চ-জটিলতা (4.96 × 10

তৈরি করেছি। 9) pNb লাইব্রেরি (বর্ধিত ডেটা চিত্র 8))। PANL ব্যবহার করে pNbs সনাক্তকরণ প্রদর্শনের জন্য, আমরা EGFP-GPI-প্রকাশকারী HEK293T কোষগুলির বিরুদ্ধে একটি নির্বাচন করেছি, যখন অভিভাবকীয় HEK293T কোষগুলি ব্যবহার করে পাল্টা নির্বাচন করেছি (চিত্র 4a)। তিনটি নির্বাচন রাউন্ডের বেশি, আমরা EGFP-GPI+ দাগ দিয়ে pNbs-এর সমৃদ্ধি পর্যবেক্ষণ করেছি 4b)। উপরন্তু, আমরা PANL এবং প্রতিটি আউটপুট লাইব্রেরি উভয় ক্রমানুসারে নির্বাচনের মূল্যায়ন করেছি পদ্ধতি), সংক্ষিপ্ত CDR3- আশ্রয়দানকারী pNbs-এর আপেক্ষিক বৃদ্ধি এবং প্রতিটি নির্বাচন রাউন্ডের পরে পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের pNbs-এর একটি সমৃদ্ধকরণ খুঁজে পাওয়া (বর্ধিত ডেটা চিত্র। 9a)। আউটপুট লাইব্রেরিগুলিতে ইনপুট PANL (বর্ধিত ডেটা চিত্র 9b)। স্বতন্ত্র pNb ক্লোনগুলির ক্রমাগত সম্প্রসারণ ছিল, সর্বাধিক প্রচুর ক্লোনগুলি 0.2-8% প্রতিনিধিত্ব করে এবং শীর্ষ 1,000 ক্লোনগুলি চূড়ান্ত আউটপুট লাইব্রেরির 72.6% গঠন করে (চিত্র 4c, d)। প্রত্যাশিত হিসাবে, প্রভাবশালী ক্লোনগুলির উত্থান সামগ্রিক লাইব্রেরি জটিলতা হ্রাসের সাথে মিলে যায়, প্রতিটি নির্বাচন রাউন্ডে নির্বাচন-চালিত অভিসার চিত্রিত করে (চিত্র 4e)। চূড়ান্ত (তৃতীয়) নির্বাচনের পর 94টি ক্লোনের স্ক্রীনিং দেখায় যে অন্তত 95% ক্লোন EGFP-GPI+

স্বীকৃত শক্তিশালী বাইন্ডিং সহ কোষ প্রশ্ন

2/ প্রশ্ন

1> 1; চিত্র। figure44f এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র। 9c,d)। যেহেতু ক্লোনগুলি EGFP-GPI+ আবদ্ধ করার ক্ষমতার মধ্যে বৈচিত্র্যময় কোষে, আমরা স্যাঙ্গার সাতটি ক্লোনের (পাঁচটি শক্তিশালী এবং দুটি দুর্বল বাইন্ডার) ফেজমিড সন্নিবেশগুলিকে সিকোয়েন্স করেছি, অভিন্ন Nb সন্নিবেশগুলিকে আশ্রয় করে একাধিক ক্লোন উন্মোচন করে (A2 এবং C1, B8 এবং E3; বর্ধিত ডেটা চিত্র

9e)। এই বাছাই করা ক্লোনগুলির মধ্যে রয়েছে দ্বিতীয় (ক্লোন A2/C1), তৃতীয় (C5) এবং চতুর্দশ (B8/E3) চূড়ান্ত আউটপুট লাইব্রেরির মধ্যে সর্বাধিক প্রচুর ক্লোন (বর্ধিত ডেটা চিত্র।

9f), টার্গেট অ্যান্টিজেন-বাইন্ডিং pNbs এর সফল নির্বাচন নিশ্চিত করে। অবশেষে, একটি নির্বাচিত ক্লোন (C5) এবং একটি রিপোর্ট করা উচ্চ-সম্পর্কের অ্যান্টি-EGFP Nb টিকা দেওয়া প্রাণী থেকে প্রাপ্ত এর পাশাপাশি তুলনা 19 EGFP-GPI+ কোষে অনুরূপ বাঁধাই নির্দেশিত (চিত্র।

4g)। এই ফলাফলগুলি আগ্রহের সেলুলার অ্যান্টিজেন সনাক্ত করতে এবং পরিমাপ করার জন্য pNbs-এর দ্রুত নির্বাচনের জন্য PANL-এর উপযোগিতা এবং একক-কোষ জিনোমিক্সের জন্য বারকোডযুক্ত অ্যাফিনিটি রিএজেন্টগুলির একটি টুলবক্স তৈরির সম্ভাবনা প্রদর্শন করে।
চিত্র. 4: মাল্টিপ্লেক্সড PHAGE-ATAC-এর জন্য PANL ব্যবহার করে অ্যান্টিজেন-নির্দিষ্ট ফেজ Nbs-এর ফেজ ডিসপ্লে নির্বাচন।

ag, ফেজ ডিসপ্লে PHAGE-ATAC Nbs নির্বাচন। a, PANL ব্যবহার করে নির্বাচন পদ্ধতি)। PANL-কে HEK293T-EGFP-GPI-এর বিরুদ্ধে প্যান করা হয়েছে এবং অ্যান্টিজেন-বিহীন HEK293T-এর বিরুদ্ধে পাল্টা নির্বাচন করা হয়েছে৷ আবদ্ধ ফেজগুলি ইলুটেড, ব্যাকটেরিয়া সংক্রমিত এবং আউটপুট লাইব্রেরি তৈরি হয়। একাধিক রাউন্ডের পরে, আউটপুটটি ইলুমিনা সিকোয়েন্সড হয় এবং ফেজ ক্লোনগুলি বাছাই করা হয়, ফেজমিডগুলি আলাদা করা হয় এবং ক্রমানুসারে সন্নিবেশ করা হয়। b

, নির্বাচনের ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ অগ্রগতি EGFP ফ্লুরোসেন্সের ফ্লো সাইটোমেট্রি প্লট y অক্ষ) এবং ফেজ বাঁধাই এক্স অক্ষ, Alexa Fluor-647 এলাকা) থেকে HEK293T-EGFP-GPI (EGFP

হাই

এবং EGFPlo) ইনপুট লাইব্রেরিতে, বাম থেকে এবং পরপর নির্বাচন চক্রের পরে (এছাড়াও বর্ধিত ডেটা চিত্র দেখুন। 2c এবং পদ্ধতি)। c–

ই, নির্বাচন অগ্রগতির ইলুমিনা সিকোয়েন্সিং বিশ্লেষণ। c, নির্বাচিত শীর্ষ 35 জনের অনুপাত ক্লোন (c, y

অক্ষ), শীর্ষ 500 এবং 1,000 ক্লোন d, এক্স

অক্ষ), এবং ল্যান্ডার-ওয়াটারম্যান লাইব্রেরি জটিলতার অনুমান , y অক্ষ) ফেজ লাইব্রেরি জুড়ে এক্স অক্ষ)। আনুমানিক/আনুমানিক। f, ফ্লো সাইটোমেট্রি স্ক্রিন 94 pNbs নির্বাচন রাউন্ড 3 থেকে প্রাপ্ত। প্রশ্ন2/প্রশ্ন1টি সংকেত (যেভাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছে b) দাগ দেওয়ার সময় দেখানো হয়েছে HEK293T-EGFP-GPI (EGFPhi এবং EGFPlo ) রাউন্ড 3 নির্বাচনের পরে পৃথক pNbs সহ কক্ষ। ড্যাশড লাইন: প্রশ্ন2/ প্রশ্ন 1=1 থ্রেশহোল্ড পজিটিভ ক্লোন কল করার জন্য ব্যবহৃত হয়। g, EGFP এর ফ্লো সাইটোমেট্রি প্লট ফ্লুরোসেন্স y অক্ষ) এবং ফেজ বাঁধাই (এক্স অক্ষ, Alexa Fluor-647 এলাকা) থেকে HEK293T-EGFP-GPI সেল (EGFPhi এবং EGFPlo) টিকা-ভিত্তিক ব্যবহার করে 19 অ্যান্টি-EGFP pNb (মিডল), নির্বাচিত ক্লোন C5 ( ডান) এবং অ্যান্টি-এমচেরি নিয়ন্ত্রণ (বাম)। h–মি, একটি 12-প্লেক্স প্যানেল সহ মাল্টিপ্লেক্সড PHAGE-ATAC অ্যান্টি-SARS-CoV-2-S pNbs, অ্যান্টি-EGFP এবং PBMCs সহ, ​​মিশ্র-কোষের জনসংখ্যার মধ্যে pNbs সনাক্তকরণ। h, পরিকল্পিত ওভারভিউ। i, scATAC এর 2D এম্বেডিং PBMC, HEK293T-EGFP-GPI+ এর মিশ্রণ থেকে seq প্রোফাইল কোষ এবং HEK293T SARS-CoV-2-S+ সেলুলার উপাদান (বাম), টীকাযুক্ত কোষের ধরন (ডান) বা পরিমাপিত PDT-এর স্তর (নীচে) দ্বারা রঙিন কোষ। j, পারস্পরিক একচেটিয়া PDT সনাক্তকরণ। সাতটি অ্যান্টি-SARS-CoV-2-S pNbs থেকে PDT গণনা (জ্যামিতিক গড়) y অক্ষ) এবং দুটি অ্যান্টি-EGFP pNbs এক্স অক্ষ) প্রতিটি ঘরে দেওয়া আছে (বিন্দু, টাইপ অনুসারে রঙিন আমি) . k–মি, বিভিন্ন pNbs থেকে প্রোটিন স্তর অনুমানের চুক্তি একই প্রোটিন। k

, পিয়ারসনের r

(রঙ) প্রতিটি কক্ষ জুড়ে PDT-এর (কলাম এবং সারি) জন্য। l,মি, pNbs এর PDTs এক্স এবং y অক্ষ) SARS-CoV-2-S চিনতে l) অথবা EGFP মি) সমস্ত কক্ষ জুড়ে (বিন্দু, রঙিন i)। উপরের বাম: পিয়ারসনের r

.

রিকম্বিন্যান্ট পিএনবিএস ব্যবহার করে হোস্ট এবং SARS-CoV-2 এপিটোপের পরিমাপ

অবশেষে , আমরা PHAGE-ATAC ব্যবহার করে মাল্টিপ্লেক্স এপিটোপ সনাক্তকরণ এবং একাধিক লক্ষ্য-নির্দিষ্ট pNbs সহ অ্যান্টিজেন নিরীক্ষণ করার ক্ষমতা প্রদর্শন করেছি। আমরা গুরুতর তীব্র শ্বাসযন্ত্রের সিন্ড্রোম (SARS)-CoV-2 স্পাইক প্রোটিন (SARS-CoV-2-S) এর উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছি, যা প্রাকৃতিক এবং ভ্যাকসিন-প্ররোচিত COVID19 প্রতিরোধ ক্ষমতার প্রধান লক্ষ্য

27। প্রকাশিত অ্যান্টি-SARS-CoV-2-S Nb সিকোয়েন্সের উপর ভিত্তি করে28 পদ্ধতি), আমরা 28 pNbs তৈরি করেছি এবং সেগুলিকে SARS-CoV-2-S-এর বিরুদ্ধে স্ক্রীন করেছি। HEK293T কোষ প্রকাশ করা (চিত্র 4ঘন্টা)। ফ্লো সাইটোমেট্রি SARS-CoV-2-S+ এর নির্দিষ্ট দাগ প্রকাশ করেছে সমস্ত পরীক্ষিত pNbs দ্বারা কোষ (বর্ধিত ডেটা চিত্র 10a) এবং আমরা PHAGE-ATAC-এর জন্য সর্বোচ্চ সংকেত সহ শীর্ষ সাতটি pNbs নির্বাচন করেছি৷ আমরা সাতটি অ্যান্টি-SARS-CoV-2-S Nbs, দুটি অ্যান্টি-EGFP Nbs (PANL-প্রাপ্ত ক্লোন C5 সহ) এবং তিনটি PBMC-স্বীকৃত pNbs (এন্টি-CD4, CD8 এবং CD16) এর একটি বারো-প্লেক্স প্যানেল তৈরি করেছি, এবং PBMCs, SARS-CoV-2-S+ HEK293T কোষ এবং EGFP-GPI+ HEK293T কোষ দ্বারা PHAGE-ATAC (চিত্র 4ঘন্টা)। 4,690টি সেল বারকোডের ফিল্টার করা ডেটাসেট প্রত্যাশিত অনুপাতে PBMCs এবং HEK293T সেলগুলিকে প্রকাশ করেছে, প্রত্যাশিত কোষের অবস্থা পুনরুদ্ধার করেছে এবং সফলভাবে সম্পূর্ণ pNb প্যানেল সনাক্ত করেছে (চিত্র 4i এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 10b,c)। অ্যান্টি-SARS-CoV-2-S, অ্যান্টি-EGFP এবং অ্যান্টি-PBMC PDTs-এর পারস্পরিক একচেটিয়া সনাক্তকরণ ছিল (চিত্র 4j এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র।

10d–g) এবং একই অ্যান্টিজেন (পিয়ারসনস r=০.৮৭–০.৯৫; চিত্র 4k–m )। এইভাবে, PHAGE-ATAC প্রকাশিত এবং PANL-প্রাপ্ত উভয় pNbs সহ হোস্ট এবং ভাইরাল অ্যান্টিজেনগুলির মাল্টিপ্লেক্স একক-কোষ সনাক্তকরণের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।

আলোচনা

)

ফেজ-এটিএসি কোষ-পৃষ্ঠের একক-কোষ প্রোফাইলিং এবং অন্তঃকোষীয় প্রোটিন, ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটি এবং এমটিডিএনএর ভিত্তি হিসাবে রিকম্বিন্যান্ট ফেজ ডিসপ্লে প্রযুক্তির শক্তি ব্যবহার করে। এটি ব্যবহারকারীদের পুলড ফেজ লাইব্রেরি প্রস্তুতির পুনর্নবীকরণযোগ্য প্রকৃতি এবং মাপযোগ্যতার পাশাপাশি Nbs

এর কম্প্যাক্ট আকার এবং স্থায়িত্ব লাভ করতে দেয় 15

। ফেজ এনবিএস এবং অ্যান্টিবডিগুলির মধ্যে সখ্যতা এবং আকারের পার্থক্য থাকা সত্ত্বেও, আমাদের PHAGE-ATAC এর বিস্তৃত বেঞ্চমার্কিং প্রোটিন এক্সপ্রেশনের অত্যন্ত নির্দিষ্ট এবং সংবেদনশীল পর্যবেক্ষণ প্রদর্শন করেছে। যেমনটি আমরা আগে দেখিয়েছি, এমটিডিএনএ খণ্ডগুলির শক্তিশালী ক্যাপচার এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মিউটেশন সনাক্তকরণ ক্লোনাল ট্রেসিংয়ের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে

11

,12,

২৯

এবং PHAGE-ATAC ব্যবহার করে প্রোটিন এক্সপ্রেশন এবং কোষের অবস্থার সাথে বংশ তথ্যের একীকরণ সক্ষম করবে। যদিও PHAGE-ATAC-তে পরিমাপ করা ডেটা পদ্ধতিগুলি সম্প্রতি রিপোর্ট করা অলিগো-বারকোড-অ্যান্টিবডি-ভিত্তিক মাল্টিমডাল পদ্ধতি দ্বারা রেকর্ড করা তথ্যের সাথে সাদৃশ্যপূর্ণ 9,

10

, PHAGE-ATAC-তে জেনেটিক বারকোডিং এবং রিকম্বিন্যান্ট অ্যাফিনিটি রিএজেন্টগুলির অনন্য ব্যবহার জটিল ফেজ লাইব্রেরি ব্যবহার করে অতি-উচ্চ মাল্টিপ্লেক্সড এপিটোপ পরিমাপের পথ তৈরি করে। আমরা আরও কল্পনা করি যে টিউমার সহ কঠিন টিস্যুগুলির ভবিষ্যতের অধ্যয়নের জন্য PHAGE-ATAC বিশেষ আগ্রহের বিষয় হবে। আমরা PHAGE-ATAC-কে একটি অভিযোজিত সরঞ্জাম হিসাবে কল্পনা করি যা ফেজমিড গণনা এবং ফেজ ডিসপ্লে অ্যাপ্লিকেশনগুলিতে ব্যবহৃত অন্যান্য প্রকৌশলী স্ক্যাফোল্ডগুলির জন্য অনন্য আণবিক শনাক্তকারীর সাথে আরও একত্রিত হতে পারে (উদাহরণস্বরূপ, scFv, Fab)

30

। ভবিষ্যতে, রিকম্বিন্যান্ট অ্যাফিনিটি রিএজেন্টগুলির বড় প্যানেলের ব্যবহার উচ্চ থ্রুপুট এবং নির্দিষ্টতায় প্রোটিওম, এপিজেনোম এবং অন্যান্য রিডআউটগুলির মাল্টিমডাল, একক-কোষ বৈশিষ্ট্যকে উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করতে পারে।

পদ্ধতি

অলিগোনিউক্লিওটাইডস

অলিগোনিউক্লিওটাইড ক্রমগুলি পরিপূরক সারণীতে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে 1। অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলি ইন্টিগ্রেটেড ডিএনএ টেকনোলজি (IDT) থেকে অর্ডার করা হয়েছিল যদি না অন্যথায় নির্দেশিত হয়।

PHAGE-ATAC এর জন্য PAC-ট্যাগযুক্ত Nb–p3 ফিউশন প্রদর্শনের জন্য ফেজমিডের ক্লোনিং

ভিত্তিক 10× scATAC পুঁতির অলিগো ডিজাইনে (বর্ধিত ডেটা চিত্র 1c), আমরা অনুমান করেছি যে Nb CDR3 বারকোডের সাথে একটি RD1 প্রবর্তন ড্রপলেট-ভিত্তিক সূচীকরণের সময় অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন টুকরোগুলির পাশাপাশি বারকোড ক্যাপচার সক্ষম করবে৷ RD1 প্রবর্তনের কারণে Nb–p3 ফিউশন অনুবাদের অকাল সমাপ্তি এড়াতে, আমরা RD1-স্প্যানিং রিডিং ফ্রেমটি সংশোধন করেছি, যার ফলে একটি 12-অ্যামিনো অ্যাসিড PHAGE-ATAC ট্যাগ (PAC-tag) প্রকাশ পেয়েছে। PAC-ট্যাগ এবং p3 উভয়ের সি-টার্মিনাল ফিউশনের জন্য একটি ফেজমিড তৈরি করতে, 20 ng pDXinit (অ্যাডজেন, ক্যাটালগ নং 110101) PfuUltraII (Agilent-5µl) ব্যবহার করে প্রাইমার EF77 এবং EF78 সহ সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিসের শিকার হয়েছিল। প্রতিক্রিয়া পিসিআর শর্ত ছিল: 3 মিনিটের জন্য 95 °সে; 30 সেকেন্ডের জন্য 95 °সে, 1 মিনিটের জন্য 60 °সে এবং 12 মিনিটের জন্য 68° সেকেন্ডে 19টি চক্র; এবং 14 মিনিটের জন্য 72 ডিগ্রি সেলসিয়াসে একটি চূড়ান্ত এক্সটেনশন। টেমপ্লেট DNA 1.5 ঘন্টার জন্য 37 °C তাপমাত্রায় DpnI (ফাস্টডিজেস্ট, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এর 1.5 μl যোগ করে হজম করা হয়েছিল। পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলি তখন জিনজেট জেল ই ব্যবহার করে শুদ্ধ করা হয়েছিল এক্সট্র্যাকশন কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এবং 45 µl জলে নির্গত, তারপরে 20 µl এলুয়েট রাসায়নিকভাবে সক্ষম এসচেরিচিয়া কোলি (NEB Stable Competent) এবং অ্যাম্পিসিলিন (LB-Amp) ধারণকারী লাইসোজেনি ঝোলের উপর প্রলেপিত , ফলন pDXinit-PAC. Nb-PAC–p3, ফিউশন-এনকোডিং ফেজমিড, এনবি সিকোয়েন্সের ক্লোনিংয়ের জন্য (পরিপূরক সারণী 3) আইডিটি থেকে জিব্লক হিসাবে অর্ডার করা হয়েছিল। তারপরে, 25-এনজি এনবি জিব্লকগুলিকে প্রথমে পিসিআর দ্বারা সাপিআই সীমাবদ্ধতা সাইটগুলি প্রবর্তন করার জন্য প্রশস্ত করা হয়েছিল। CD4 Nb-এর জন্য প্রাইমার EF87 এবং EF88, CD16 Nb-এর জন্য প্রাইমার EF87 এবং EF89, CD8 Nb-এর জন্য প্রাইমার EF104 এবং EF105, CEACAM4 Nb-এর জন্য প্রাইমার EF299 এবং EF300, এবং প্রাইমারগুলি EF176-EF213-এর জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল- সকলের জন্য। Nbs স্বীকৃতি Q5 (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস (NEB)) ব্যবহার করে 50-μl পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলিকে সাইকেল করা হয়েছিল: 1 মিনিটের জন্য 98 °সে; 15 সেকেন্ডের জন্য 98 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 35টি চক্র, 30 সেকেন্ডের জন্য 60 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 30 সেকেন্ডের জন্য 72 ডিগ্রি সেলসিয়াস; এবং 3 মিনিটের জন্য 72 °C এর চূড়ান্ত এক্সটেনশন। পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলি 1% অ্যাগারোজ জেলের উপর লোড করা হয়েছিল, প্রত্যাশিত ব্যান্ডগুলি কাটা হয়েছিল এবং একটি জিনজেট জেল এক্সট্রাকশন কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে পিসিআর পণ্যগুলি বের করা হয়েছিল এবং 40 μl জলে নির্গত করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত এফএক্স সিস্টেম ব্যবহার করে ক্লোনিং করা হয়েছিল

31

। সংক্ষেপে, প্রতিটি বিলুপ্ত সন্নিবেশ 10-μl প্রতিক্রিয়ায় 1:5 (ভেক্টর: সন্নিবেশ) এর মোলার অনুপাতের 50 ng pDXinit-PAC এর সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 1 ঘন্টার জন্য 0.5 μl SapI (NEB) দিয়ে হজম করা হয়েছিল। SapI-কে নিষ্ক্রিয় করার জন্য 65 °C তাপমাত্রায় প্রতিক্রিয়াগুলি 20 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় শীতল করা হয়েছিল, এবং 10× T4 ligase বাফার (NEB) এর 1.1 μl এবং T4 ligase (NEB) এবং incubated এর 0.25 μl যোগ করে নির্মাণগুলি বন্ধ করা হয়েছিল। 25 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 1 ঘন্টার জন্য। 65 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 20 মিনিটের জন্য তাপ নিষ্ক্রিয়করণের মাধ্যমে বন্ধন বন্ধ করা হয়েছিল, তারপরে ঘরের তাপমাত্রায় শীতল করা হয়েছিল। লিগেশন প্রতিক্রিয়া, 2 μl, রাসায়নিকভাবে সক্ষম তে রূপান্তরিত হয়েছিল ই. কোলি (এনইবি স্থিতিশীল সক্ষম) এবং 5% সুক্রোজ-যুক্ত LB-অ্যাম্পের উপর ধাতুপট্টাবৃত, pDXinit-CD4Nb-PAC, pDXinit-CD8Nb-PAC, pDXinit-CD16Nb-PAC, pDXinit-CEACAM4Nb-PAC এবং pDXinit-CEACAM4Nb-PAC এবং সমস্ত 2it-8-এ SARS2-SNb-PAC নির্মাণ। CD8 হ্যাশট্যাগ ফেজমিডের ক্লোনিংয়ের জন্য, pDXinit-CD8Nb-PAC-এর 20 ng pDXinit-CD8Nb-PAC ব্যবহার করা হয়েছিল সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিসের জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে (যেমন আগে বর্ণনা করা হয়েছে), প্রাইমার EF156 এবং EF157 ব্যবহার করে pDXinit-CD8Nb(PH-A)-PAC, প্রাইমার তৈরি করতে pDXinit-CD8Nb(PH-B)-PAC-এর জন্য EF158 এবং EF159, pDXinit-CD8Nb(PH-C)-PAC-এর জন্য প্রাইমার EF164 এবং EF165, এবং pDXinit-CD8Nb(PH-D)-PAC-এর জন্য প্রাইমার EF166 এবং EF167৷ ইজিএফপি এনবি-প্রদর্শনকারী ফেজেমিডের ক্লোনিংয়ের জন্য, পিওপিন জিএফপি ন্যানোবডি (অ্যাডজেন, ক্যাটালগ নং 49172) থেকে EGFP এনবি ক্রমটি 25 এনজি এবং ইএফএফ06 প্রাইমপ্লাজমিড ব্যবহার করে Q5 (NEB) এর সাথে 50-µl পিসিআর প্রতিক্রিয়াতে প্রশস্ত করা হয়েছিল। . EGFP Nb সন্নিবেশ এফএক্স ক্লোনিং ব্যবহার করে pDXinit-এ ক্লোন করা হয়েছিল (আগে বর্ণিত), pDXinit-EGFPNb ফলন। বিভিন্ন ওরিয়েন্টেশনে RD1 সম্বলিত EGFP Nb-প্রদর্শনকারী phagemids pDXinit-EGFPNb ব্যবহার করে এবং pDXinit-EGFPNb-PAC প্রাপ্ত করার জন্য বা EF75 এবং EF75 এবং EFD16-74-এর সাথে EF73 এবং EF74-এর সাথে সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিস (আগে বর্ণিত) সম্পাদন করে ক্লোন করা হয়েছিল। (5-3)। পিডিটি লাইব্রেরি পরিবর্ধনের জন্য প্রয়োজনীয় একটি পিসিআর হ্যান্ডেল প্রবর্তনের জন্য, pDXinit-EGFPNb-PAC প্রাইমার EF78 এবং EF79 ব্যবহার করে সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিসের শিকার হয়েছিল (যেমন পূর্বে বর্ণিত হয়েছে), pDXinit-EGFPNb(হ্যান্ডেল)-PAC প্রদান করে। mCherry Nb-প্রদর্শনকারী phagemids-এর ক্লোনিংয়ের জন্য, pGex6P1 mCherry Nb (Addgene, ক্যাটালগ নং 70696) থেকে mCherry Nb সিকোয়েন্স 25 ng এবং EFF08 প্রাইমমিড এবং EFF08 টেম্পার ব্যবহার করে Q5 (NEB) এর সাথে 50-µl পিসিআর বিক্রিয়ায় প্রশস্ত করা হয়েছিল। . mCherry Nb সন্নিবেশ এফএক্স ক্লোনিং ব্যবহার করে pDXinit-এ ক্লোন করা হয়েছিল (যেমন আগে বর্ণনা করা হয়েছে), ফলন pDXinit-mCherryNb। সমস্ত নির্মাণ পরিপূরক সারণীতে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে .

RD1-যুক্ত প্রাইমার ব্যবহার করে RD1-মধ্যস্থতাযুক্ত ফেজেমিড পরিবর্ধনের বিশ্লেষণ

pDXinit-EGFPNb, pDXinit-EGFPNb-PAC বা pDXinit-EGFPNb-RD1(এর 5-3), 5 ng প্রাইমার EF170 এবং 2× KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche) এর 5 μl ব্যবহার করে রৈখিক PCR (10-µl প্রতিক্রিয়া ভলিউম) এবং সাইকেল চালানোর অবস্থার শিকার হয়েছিল: 2 মিনিটের জন্য 98 °C; 10 সেকেন্ডের জন্য 98 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 12টি চক্র, 30 সেকেন্ডের জন্য 59 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 1 মিনিটের জন্য 72 ডিগ্রি সেলসিয়াস; এবং 5 মিনিটের জন্য 72 °C এর চূড়ান্ত এক্সটেনশন। সমাপ্তির পরে, প্রতিটি প্রাইমার EF147 এবং EF57 এর 0.625 μl, 1.25 μl জল এবং 2× KAPA এর 12.5 μl যোগ করা হয়েছিল৷ Nb-নির্দিষ্ট PCR ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল: 3 মিনিটের জন্য 98 °C; 15 সেকেন্ডের জন্য 98 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 30টি চক্র, 20 সেকেন্ডের জন্য 65 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 1 মিনিটের জন্য 72 ডিগ্রি সেলসিয়াস; এবং 5 মিনিটের জন্য 72 °C এর চূড়ান্ত এক্সটেনশন। প্রাইমার EF57 এবং EF58 এবং নির্দেশিত প্লাজমিড টেমপ্লেট ব্যবহার করে পিসিআর একটি পরিবর্ধন নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।

ফেজ উৎপাদন

ফেজমিড-ধারণকারী SS320 (লুসিজেন) সংস্কৃতিগুলি ইনকিউবেট করা হয়েছিল রাতারাতি 2YT/2%/A/T 37 °C এবং 240 rpm কালচারগুলি 2YT/2%/A/T তে 1:50 পাতলা করা হয়েছিল এবং অপটিক্যাল ঘনত্ব পর্যন্ত 37 °C এবং 240 rpm-এ 2-3 ঘন্টার জন্য বেড়েছে 600 nm (OD600)=০.৪–০.৫। ব্যাকটেরিয়া, 5 মিলি, তখন M13K07 হেল্পার ফেজ (NEB) এর 200 μl দ্বারা সংক্রামিত হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 60 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। ব্যাকটেরিয়া সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 50 μg ml−1 ধারণ করে 2YT-এর 50 মিলিলিটারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। অ্যাম্পিসিলিন এবং 25 μg মিলি−1 কানামাইসিন (2YT/A/K) এর। 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 240 rpm তাপমাত্রায় ইনকিউবেশনের মাধ্যমে রাতারাতি ফেজগুলি তৈরি করা হয়েছিল এবং 20% পলি (ইথিলিন গ্লাইকোল)-6000/2.5 M NaCl দ্রবণ এবং 75 মিনিটের জন্য বরফের উপর ইনকিউবেশনের এক চতুর্থাংশ ভলিউম যোগ করে সুপারন্যাট্যান্টস থেকে ফেজগুলি তৈরি করা হয়েছিল। . ফেজগুলি সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা সংগ্রহ করা হয়েছিল (17 মিনিট, 12,500g

, 4 °সে)। ফেজ পেলেটগুলি 1.2 মিলি ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইনে (পিবিএস) পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল, সাসপেনশনগুলি সাফ করা হয়েছিল (5 মিনিট, 12,500 g, 25 ডিগ্রি সেলসিয়াস) এবং ফেজ ধারণকারী সুপারনাট্যান্ট সংরক্ষণ করা হয়েছিল।

সেল সংস্কৃতি

NIH3T3 (আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন (ATCC), ক্যাটালগ নং CRL-1658) এবং HEK293T সেল (ATCC, ক্যাটালগ নং CRL-3216) Dulbecco-এর মধ্যে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল 10% ভ্রূণ বোভাইন সিরাম (FBS), 2 মিমি সমন্বিত ঈগলের মাধ্যম (DMEM) l

-গ্লুটামিন এবং 100 ইউ মিলি – 1 পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক), এবং 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 5% CO2

। উপ-সংস্কৃতির জন্য, মাঝারি উচ্চাকাঙ্খী ছিল, কোষগুলিকে পিবিএস দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং ট্রিপসিন-ইথিলেনেডিয়ামিনেটেট্রাসেটিক অ্যাসিড (ইডিটিএ) 0.25% (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দিয়ে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। সংস্কৃতি মাধ্যম দিয়ে বিচ্ছিন্নতা প্রতিক্রিয়া বন্ধ করা হয়েছিল এবং কোষগুলি পছন্দসই ঘনত্বে বীজযুক্ত হয়েছিল। সেল স্টকগুলি FBS-এ 10% ডাইমিথাইল সালফক্সাইড সহ সেল অ্যালিকোটগুলিকে পুনরায় স্থগিত করে এবং −80 °C তাপমাত্রায় ধীরে ধীরে হিমায়িত করে প্রস্তুত করা হয়েছিল। হিমায়িত অ্যালিকোটগুলি দীর্ঘমেয়াদী স্টোরেজের জন্য তরল নাইট্রোজেনে স্থানান্তরিত হয়েছিল। সমস্ত সেল লাইন নিয়মিতভাবে পরীক্ষা করা হয়েছিল মাইকোপ্লাজমা দূষণ।

HEK293T কোষের প্লাজমিড ট্রান্সফেকশন

স্থানান্তরের একদিন আগে, 2 × 106 HEK293T কোষগুলি 10-সেমিতে বীজ করা হয়েছিল সম্পূর্ণ সংস্কৃতির মাধ্যমে থালা-বাসন (কর্নিং) (যেমন

সেল সংস্কৃতি

). জিনজুইস রিএজেন্ট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে ট্রান্সফেকশন করা হয়েছিল। তারপরে, 600 μl Opti-MEM এবং 12 μl GeneJuice 1.5-মিলি টিউবে মিশ্রিত করা হয়েছিল, খুব শীঘ্রই ঘূর্ণায়মান হয়েছিল এবং নিচের দিকে কাত হয়েছিল। প্লাজমিড ডিএনএ, 4 µg (pCAG (Addgene, ক্যাটালগ নং. 11160), pCAC-EGFP (অ্যাডজেন, ক্যাটালগ নং. 89684), pCAC-EGFP-GPI (অ্যাডজেন, ক্যাটালগ নং. 32601) বা pHDM-SARSDadge2 (এসএডিএডিজেন) , ক্যাটালগ নং. 155130)), যোগ করা হয়েছিল, এবং টিউবগুলি খুব শীঘ্রই ঘূর্ণায়মান হয়েছিল এবং নিচে কাত হয়েছিল। ট্রান্সফেকশন মিশ্রণটি HEK293T কোষে ড্রপওয়াইজে যোগ করা হয়েছিল। কোষগুলি 24 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 5% CO

2

ট্রান্সজিন এক্সপ্রেশনের অনুমতি দিতে। সফল স্থানান্তর একটি EVOS M5000 এ ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল।ফেজ বাইন্ডিং সনাক্তকরণের জন্য প্রবাহ সাইটোমেট্রি

হার্ভেস্টেড অ্যান্টিজেন এক্সপ্রেসিং সেল লাইন বা গলানো PBMCs (ফসল কাটা এবং গলানো প্রোটোকলের জন্য, PHAGE-ATAC ওয়ার্কফ্লো দেখুন) কোল্ড ফ্লো সাইটোমেট্রি বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল (FC বাফার: PBS এর মধ্যে 2% FBS) এবং 4 ° এ একটি রোটেটারে 20 মিনিটের জন্য সংশ্লিষ্ট pNbs দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। গ. কোষগুলিকে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং আনবাউন্ড ফেজগুলি অপসারণ করতে দুইবার ঠান্ডা এফসি বাফার দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল (সমস্ত সেন্ট্রিফিউগেশন ধাপ ছিল 350g, 4 মিনিট, 4 °সে)। ফিক্সেশন এবং লাইসিস অবস্থার অপ্টিমাইজেশনের জন্য, কোষগুলি 0.1% বা 1% ফর্মালডিহাইড (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে স্থির করা হয়েছিল এবং এনপি-40, ডিজিটোনিন বা টুইন-20 এর বিভিন্ন ঘনত্ব ধারণকারী লাইসিস বাফারগুলির সাথে ব্যাপ্ত করা হয়েছিল। এফসি বাফারে কোষগুলি পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং অ্যান্টি-M13 অ্যান্টিবডি (সিনো বায়োলজিক্যাল, ক্যাটালগ নং 11973-MM05T-50) 1:500 ডিলিউশনে যোগ করা হয়েছিল। বরফের উপর 10 মিনিটের পরে, কোষগুলিকে FC বাফারে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং অ্যান্টি-মাউস Fc Alexa Fluor-647-কঞ্জুগেটেড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ক্যাটালগ নং A-21236) 1:500 ডিলিউশনে যুক্ত করা হয়েছিল। কোষগুলিকে বরফের উপর 10 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল, এফসি বাফারে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে জীবিত/মৃত বৈষম্যের জন্য এফসি বাফার ধারণকারী সাইটক্স ব্লু (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। নির্দেশিত ক্ষেত্রে, কোষগুলিকে 1:500 ডিলিউশনে অ্যান্টি-CD4-FITC (ক্লোন OKT4, BioLegend) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল; এর ফলে কোনো অ্যান্টি-M13 এবং অ্যান্টি-মাউস Fc অ্যান্টিবডি ব্যবহার করা হয়নি। ব্রড ইনস্টিটিউট ফ্লো সাইটোমেট্রি সুবিধার সাইটোফ্লেক্স এলএক্স ফ্লো সাইটোমিটার (বেকম্যান কুল্টার) ব্যবহার করে দাগযুক্ত কোষগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। FlowJo সফ্টওয়্যার v.10.6.1. ব্যবহার করে ফ্লো সাইটোমেট্রি ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল CEACAM4 Nb নির্বাচন এবং বৈধতা

CEACAM4 Nbs ছিল পূর্বে বর্ণিত Nb লাইব্রেরি ব্যবহার করে ফেজ ডিসপ্লে সহ বায়োপ্যানিং দ্বারা নির্বাচিত 32

। নির্বাচিত Nbs Fc-ফিউশন প্রোটিন হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল এবং ELISA দ্বারা রিকম্বিন্যান্ট CEACAM4 (Enquire Bio, catalog no. QP5812-ec) এর সাথে আবদ্ধ হওয়ার জন্য মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 96-ওয়েল ম্যাক্সিসর্প প্লেটগুলি (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ক্যাটালগ নং 442404) প্রতি কূপে 50 μl রিকম্বিন্যান্ট CEACAM4 প্রোটিন বা বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (BSA; থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ক্যাটালগ নং BP16001) দিয়ে প্রলিপ্ত ছিল 5 μg ml−1 পিবিএস-এ এবং 4 এ রাতারাতি ইনকিউব করা হয় °সে. আবরণের পরে, প্লেটগুলি বাফার পিটি দিয়ে চারবার ধোয়া হয়েছিল (0.05% টুইন 20 সহ পিবিএস), 200 μl ব্লকিং সলিউশন (1% কেসিন সহ পিবিএস) যোগ করা হয়েছিল, প্লেটগুলি ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল এবং তারপরে আবার চারবার ধোয়া হয়েছিল। . Nbs প্রথমে 0.5 µM এ পাতলা করা হয়েছিল এবং তারপরে ব্লকিং দ্রবণে অর্ধেক লগ দ্বারা ক্রমিকভাবে পাতলা করা হয়েছিল। পাতলা Nb, 50 μl, ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য যোগ করা হয়েছিল। প্লেটগুলি চারবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং প্রতিটি কূপে 50 μl হর্সরাডিশ পারক্সিডেস অ্যান্টি-হিউম্যান ইমিউনোগ্লোবুলিন জি অ্যান্টিবডি (বায়োলিজেন্ড, ক্যাটালগ নং 410603, 1:5,000) মিশ্রিত করা হয়েছিল। ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের ইনকিউবেশনের পরে, প্লেটগুলি পিটি দিয়ে ছয়বার এবং পিবিএস দিয়ে একবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল। প্লেটগুলি 100 μl টিএমবি সাবস্ট্রেট রিএজেন্ট সেট (বিডি বায়োসায়েন্সেস, ক্যাটালগ নং 555214) দিয়ে তৈরি করা হয়েছিল এবং 1 এম সালফিউরিক অ্যাসিডের 100 μl যোগ করে 5 মিনিট পরে প্রতিক্রিয়া বন্ধ করা হয়েছিল। প্লেটগুলি তখন 450 nm এবং 570 nm তরঙ্গদৈর্ঘ্যে পড়া হয়েছিল।

ফেজ-এটিএসি ওয়ার্কফ্লো

সেলের জন্য লাইন ‘প্রজাতি-মিশ্রণ’ পরীক্ষা, সংস্কৃতির মাধ্যমটি উচ্চাকাঙ্খিত ছিল, সেল লাইনগুলি পিবিএস দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল, ট্রিপসিন–ইডিটিএ 0.25% (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে সংগ্রহ করা হয়েছিল, 10% FBS সমন্বিত ডিএমইএম-এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল, সেন্ট্রিফিউজড, পিবিএস দিয়ে ধুয়ে এবং এফসি-তে পুনরায় ব্যবহার করা হয়েছিল বাফার (উপরে)। PBMC এবং CD8 T-সেল পরীক্ষার জন্য, cryopreserved PBMCs বা CD8 T কোষ (AllCells) গলিয়ে, PBS-এ ধুয়ে ঠান্ডা FC বাফারে পুনঃস্থাপন করা হয়েছিল। সমস্ত সেন্ট্রিফিউগেশন পদক্ষেপগুলি 350 এ বাহিত হয়েছিল g 4 মিনিট এবং 4 °C এর জন্য যদি না অন্যথায় বলা হয়। 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 20 মিনিটের জন্য চাকা। এফসি বাফারে তিনটি ধোয়ার পরে, ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 1% ফর্মালডিহাইড (থার্মো সায়েন্টিফিক) ধারণকারী পিবিএস-এ কোষগুলি স্থির করা হয়েছিল। 0.125 M এর চূড়ান্ত ঘনত্বে 2.5 M গ্লাইসিন যোগ করার মাধ্যমে ফিক্সেশনটি নিভিয়ে দেওয়া হয়েছিল। কোষগুলিকে এফসি বাফারে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং লাইসিস বাফার (10 মিমি Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mMgCl) ব্যবহার করে ব্যাপ্ত করা হয়েছিল 2

, 0.1% NP-40, 1% BSA) বরফে 3 মিনিটের জন্য। এই বাফারটি ব্যবহার করা হয়েছিল কারণ আমরা দেখেছি যে স্ট্যান্ডার্ড 10× জিনোমিক্স scATAC lysis বাফারের ফলে pNb কোষের দাগ নষ্ট হয়ে যায় (বর্ধিত ডেটা চিত্র। 4)। লাইসিসের পরে, কোষগুলি 1 মিলি কোল্ড ওয়াশ বাফার (NP-40 ছাড়াই লাইসিস বাফার), উল্টানো এবং সেন্ট্রিফিউজড (5 মিনিট, 500 যোগ করে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল g, 4 °সে)। সুপারন্যাট্যান্টকে উচ্চাকাঙ্ক্ষী করা হয়েছিল এবং সেল পেলেটটি 1× নিউক্লি ডিলিউশন বাফারে (10× জিনোমিক্স) পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। সেল অ্যালিকোটগুলি ট্রিপ্যান ব্লুর সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং একটি কাউন্টেস II এফএল স্বয়ংক্রিয় সেল কাউন্টার ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল। ট্যাগমেন্টেশনের জন্য কোষের প্রক্রিয়াকরণ, 10× জিনোমিক্স চিপ লোড করা এবং 10× জিনোমিক্স ক্রোমিয়াম কন্ট্রোলার মাইক্রোফ্লুইডিক্স যন্ত্রের মাধ্যমে ড্রপলেট এনক্যাপসুলেশন ক্রোমিয়াম সিঙ্গেল সেল ATAC সলিউশন প্রোটোকল অনুযায়ী সম্পাদিত হয়েছিল।

অন্তঃকোষীয় EGFP-এর PHAGE-ATAC সনাক্তকরণের জন্য, সংগ্রহ করা কোষগুলিকে ঠান্ডা FC বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং সঙ্গে সঙ্গে PBS-এ 1% ফর্মালডিহাইড (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য স্থির করা হয়েছিল৷ 0.125 M-এর চূড়ান্ত ঘনত্বে 2.5 M গ্লাইসিন যোগ করার মাধ্যমে স্থিরকরণ করা হয়েছিল। PBS-এ কোষগুলি দুবার ধুয়ে লাইসিস বাফার (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM(MgCl) ব্যবহার করে ব্যাপ্ত করা হয়েছিল। 2

, 0.1% NP-40, 1% BSA) বরফে ৫ মিনিটের জন্য। লাইসিসের পরে, কোষগুলি 1 মিলি কোল্ড ওয়াশ বাফার (NP-40 ছাড়াই লাইসিস বাফার), উল্টানো এবং সেন্ট্রিফিউজড (5 মিনিট, 500 যোগ করে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল g, 4 °সে)। কোষগুলিকে এফসি বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 20 মিনিটের জন্য একটি ঘূর্ণায়মান চাকায় অ্যান্টি-EGFP ফেজ দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। এফসি বাফারে তিনটি ধোয়ার পর, সুপারনাট্যান্টটি উচ্চাকাঙ্খিত হয়েছিল এবং সেল পেলেটটি 1× নিউক্লি ডিলিউশন বাফারে (10× জিনোমিক্স) পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। PHAGE-ATAC-এর জন্য কোষগুলির ডাউনস্ট্রিম প্রক্রিয়াকরণ উপরে বর্ণিত হিসাবে ছিল।

প্রজাতির মিশ্রণের জন্য, একটি একক 10× চ্যানেল 20,000 কোষের সাথে ‘সুপার-লোড’ ছিল। 96-ডিপ ওয়েল রিঅ্যাকশন মডিউল (BioRad) সহ একটি C1000 টাচ থার্মাল সাইক্লারে 10× ATAC প্রোটোকলে বর্ণিত হিসাবে লিনিয়ার অ্যামপ্লিফিকেশন এবং ড্রপলেট-ভিত্তিক সূচক করা হয়েছিল। লিনিয়ার পিসিআর-এর পরে, ড্রপলেট ইমালশনগুলি ভেঙে দেওয়া হয়েছিল, বারকোডযুক্ত পণ্যগুলি MyONE সিলেন বিড ক্লিনআপ ব্যবহার করে শুদ্ধ করা হয়েছিল এবং 40 μl ইলিউশন বাফার I (ক্রোমিয়াম সিঙ্গেল সেল ATAC সলিউশন প্রোটোকল) এ বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। এই মুহুর্তে পিডিটি এবং এটিএসি লাইব্রেরি প্রস্তুতির জন্য ইলুয়েটগুলি বিভক্ত করা হয়েছিল। যেখানে নীচে বর্ণিত হিসাবে PDT লাইব্রেরি প্রস্তুতির জন্য 5 μl ইলুয়েট ব্যবহার করা হয়েছিল, বাকি 35 μl ইলুয়েট scATAC লাইব্রেরি তৈরির জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল (ক্রোমিয়াম একক সেল ATAC সলিউশন প্রোটোকল অনুসারে)। এই মুহুর্তে নমুনাগুলিকে বিভক্ত করার ফলে লাইব্রেরির জটিলতার ক্ষতি হবে বলে আশা করা যায় না কারণ PDTs এবং ATAC খণ্ডগুলি ইতিমধ্যেই লিনিয়ার PCR এর মাধ্যমে পরিবর্ধনের মধ্য দিয়ে গেছে। 2× KAPA পলিমারেজ এবং প্রাইমার EF147 এবং EF91 ব্যবহার করে 100-μl প্রতিক্রিয়াতে PDT-নির্দিষ্ট PCR-এর জন্য প্রস্তুতি ব্যবহার করা হয়েছিল; সাইকেল চালানোর অবস্থা ছিল: 3 মিনিটের জন্য 95 °সে, 20 সেকেন্ডের জন্য 95 °সে 20 সাইকেল, 30 সেকেন্ডের জন্য 60 °সে এবং 20 সেকেন্ডের জন্য 72 °সে; এবং 5 মিনিটের জন্য 72 °C এর চূড়ান্ত এক্সটেনশন। পরিবর্ধিত PDT পণ্যগুলিকে 65 μl SPRIselect পুঁতি (Beckman Coulter) যোগ করে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল; 160 µl সুপারন্যাট্যান্ট সংরক্ষণ করা হয়েছিল এবং 192 µl এসপিআরআইসিলেক্ট দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। জপমালা 800 μl 80% ইথানল দিয়ে দুবার ধোয়া হয়েছিল এবং PDT লাইব্রেরিটি 40 μl বাফার EB (QIAGEN) দ্বারা নির্গত হয়েছিল।

PDT লাইব্রেরির ঘনত্ব ছিল নির্ধারিত এবং 15 ng 100-µl সূচী PCR প্রতিক্রিয়ার জন্য 50 μl Amp-মিক্স (10× জিনোমিক্স), 7.5 μl SI-PCR প্রাইমার B (10× জিনোমিক্স) এবং 2.5 μl i7 নমুনা সূচক-ধারণকারী প্রাইমার ব্যবহার করে ব্যবহার করা হয়েছিল 10× জিনোমিক্স); সাইকেল চালানোর অবস্থা ছিল: 45 সেকেন্ডের জন্য 98 °সে; 20 সেকেন্ডের জন্য 98 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 6টি চক্র, 30 সেকেন্ডের জন্য 67 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 20 সেকেন্ডের জন্য 72 ডিগ্রি সেলসিয়াস; এবং 1 মিনিটের জন্য 72 °C এর চূড়ান্ত এক্সটেনশন। সূচীকৃত PDT লাইব্রেরিগুলি SPRIselect এর 120 μl যোগ করে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল এবং 40 μl বাফার EB-তে ইলুট করা হয়েছিল৷ চূড়ান্ত লাইব্রেরিগুলির ঘনত্ব একটি Qubit dsDNA HS Assay kit (Invitrogen) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং একটি Bioanalyzer 2100 সিস্টেমে (Agilent) একটি উচ্চ সংবেদনশীলতা DNA চিপ চালানোর মাধ্যমে আকার বিতরণ পরীক্ষা করা হয়েছিল।

PDT এবং ATAC লাইব্রেরিগুলি নেক্সটসেক 550 সিকোয়েন্সারে (ইলুমিনা) নেক্সটসেক হাই আউটপুট কার্টিজ কিট ব্যবহার করে পুল এবং পেয়ার-এন্ড সিকোয়েন্সড (2 × 34 সাইকেল) করা হয়েছিল। CellRanger-ATAC mkfastq এর সাথে কাঁচা সিকোয়েন্সিং ডেটা ডিমাল্টিপ্লেক্স করা হয়েছিল। CellRanger-ATAC কাউন্ট v.1.0. ব্যবহার করে GRCh38 বা mm10 রেফারেন্স জিনোমের সাথে সারিবদ্ধ করার জন্য ATAC fastqs ব্যবহার করা হয়েছিল PBMC-এর ASAP-seq এবং PHAGE-ASAP

ASAP-seq এবং PHAGE-ASAP-এর জন্য, PBMCগুলি ঠান্ডা FC বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং প্রথমে 4 °C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য Human TruStain FcX (BioLegend) দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল৷ তখন কোষগুলিকে টোটালসেক-এ অ্যান্টিবডি দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল (বায়োলেজেন্ড; পরিপূরক সারণীতে তালিকাভুক্ত 5) অথবা 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 20 মিনিটের জন্য একটি ঘূর্ণায়মান চাকায় ইনকিউবেশনের মাধ্যমে pNbs এবং TotalSeq-A উভয় অ্যান্টিবডি দিয়ে কস্টেইন করা হয়। তারপরে নিম্নোক্ত পরিবর্তনগুলির সাথে PHAGE-ATAC-এর জন্য উপরে বর্ণিত হিসাবে কোষগুলিকে ধুয়ে এবং প্রক্রিয়া করা হয়েছিল: ড্রপলেট এনক্যাপসুলেশন এবং বারকোডিংয়ের আগে, 1 µM TotalSeq-A ব্রিজ অলিগো EF369-এর 0.5 μl প্রতি 65 μl Chromium ATAC বারকোডিং হিসাবে বর্ণনা করা হয়েছিল। 9। MyONE সিলেন বিড ক্লিনআপের পরে, নমুনাগুলিকে 43 μl ইলিউশন বাফার I (ক্রোমিয়াম সিঙ্গেল সেল ATAC সলিউশন প্রোটোকল) এলিউট করা হয়েছিল এবং 3 μl ইলুয়েট PCR দ্বারা ADT লাইব্রেরি প্রস্তুতির জন্য প্রাইমার EF147, এবং EF370, EF371 বা EF372 থেকে ব্যবহার করা হয়েছিল। রিপোর্ট অনুযায়ী 9। PHAGE-ASAP-এর জন্য, উপরে বর্ণিত হিসাবে PDT লাইব্রেরি প্রস্তুতির জন্য 5 μl ইলুয়েট ব্যবহার করা হয়েছিল।

পিডিটি গণনা ম্যাট্রিক্স

PDT fastqs CellRanger-ATAC mkfastq চালানোর মাধ্যমে প্রাপ্ত করা হয়েছিল কাঁচা সিকোয়েন্সিং ডেটাতে এবং কাস্টমাইজড ইউনিক্স কোড ব্যবহার করা হয়েছিল PDT-সেলের বারকোড গণনা সারণী বের করতে। কাস্টমাইজড পাইথন কোড (‘phage_to_kite-R3.py’) 10× scATAC R1/R2/R3 ফাইল কনভেনশনগুলিকে কোয়ালিস্টো|বুস্টুলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ একটি পেয়ারড-এন্ড রিড ফাইল ফরম্যাটে পরিমাপ করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। ব্যবহার করে একটি k CDR3 অঞ্চলের জন্য 13 এর বেশি দৈর্ঘ্য, PDT লাইব্রেরিগুলি একটি ব্যবহারকারী-নির্দিষ্ট রেফারেন্সের সাথে ছদ্ম-সারিবদ্ধ ছিল এবং ত্রুটি-সংশোধিত বারকোড এবং বুস্টুল ব্যবহার করে প্রতি-কোষ সংখ্যা নির্ধারণ করা হয়েছিল (উভয় কক্ষের জন্য একটি অমিল পর্যন্ত বারকোড এবং CDR3 বারকোড)। উল্লেখযোগ্যভাবে, যেহেতু ফেজগুলির অনন্য আণবিক শনাক্তকারী নেই, আমরা সামঞ্জস্যপূর্ণ প্রক্রিয়াকরণের জন্য একটি ডামি পলি(A) ক্রম ব্যবহার করেছি৷ প্রজাতি-মিশ্রণ PHAGE-ATAC পরীক্ষার বিশ্লেষণ

প্রজাতি-মিশ্রন পরীক্ষা থেকে PHAGE-ATAC-seq ডেটা CellRanger-ATAC mkfastq ব্যবহার করে ডিমাল্টিপ্লেক্স করা হয়েছিল, এবং জেনারেট করা ATAC ফাস্টকিউগুলি CellRanger-ATAC গণনার সাথে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল ফিল্টার রিড, ট্রিম অ্যাডাপ্টার, GRCh38 এবং mm10 রেফারেন্স জিনোম উভয়ের রিডগুলি সারিবদ্ধ করুন, বারকোড গণনা করুন, ট্রান্সপোজেস কাট সাইটগুলি সনাক্ত করুন, অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন শিখর সনাক্ত করুন এবং সেল বারকোড কলিংয়ের জন্য কাটঅফগুলি সনাক্ত করুন৷ ‘ফোর্স-সেলস’ প্যারামিটার সেট করা হয়নি। বারকোডগুলিকে মানব বা মাউস হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল যদি> 90% বারকোড-সম্পর্কিত টুকরোগুলি যথাক্রমে GRCh38 বা mm10 এর সাথে সারিবদ্ধ হয়। সেল বারকোড কলিংয়ের জন্য কাটঅফগুলি ছিল> 3,000 ATAC খণ্ডগুলি মানুষের জন্য ওভারল্যাপিং পিকগুলি এবং মাউস বারকোডগুলির জন্য 10,000 (অভিজ্ঞতামূলক ঘনত্বের উপর ভিত্তি করে)৷ ডাবল বারকোডগুলিকে GRCh38 এবং mm10 রেফারেন্স জিনোমের সাথে সারিবদ্ধ> 10% ATAC টুকরা ধারণকারী হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল। EGFP PDT গণনা সারণীটি উত্পাদিত হয়েছে উপরে বর্ণিত ফেজ বারকোডের জন্য PDT fastqs অনুসন্ধান করে (পরিপূরক সারণী 4) এবং কল করা সেল বারকোডের সম্পূর্ণ তালিকা (মানব এবং মাউস) ব্যবহার করে ফিল্টারিংয়ের মাধ্যমে পিডিটি-সম্পর্কিত সেল বারকোড প্রাপ্ত করা।

HEK293T-EGFP-GPI (EGFP+ এর প্রবাহ সাইটোমেট্রি পরিমাপের পরে ) এবং HEK293T কোষ (EGFP), FCS ফাইলগুলি CytExpert সফ্টওয়্যার (Beckman Coulter) ব্যবহার করে রপ্তানি করা হয়েছিল। ফরোয়ার্ড স্ক্যাটার (এফএসসি এলাকা) এবং ইজিএফপি ফ্লুরোসেন্স (এফআইটিসি এলাকা) এর মানগুলি এফসিএস ফাইলগুলি থেকে নেওয়া হয়েছিল। মানব EGFP+ এবং EGFP কোষগুলিকে EGFP PDT গণনা (PHAGE-ATAC-এর জন্য) বা উভয় জনসংখ্যার মধ্যে ন্যূনতম মানের একটি গেট সেট করে FITC-এরিয়া মান (প্রবাহ সাইটোমেট্রির জন্য) দ্বারা উপস্থাপিত EGFP ফ্লুরোসেন্স।

PBMC PHAGE-ATAC এর বিশ্লেষণ, ASAP -seq এবং PHAGE-ASAP পরীক্ষা

PBMC-এর PHAGE-ATAC, ASAP-seq এবং PHAGE-ASAP লাইব্রেরি থেকে সিকোয়েন্সিং ডেটা সেলরেঞ্জার-ATAC ব্যবহার করে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল সমস্ত ডিফল্ট প্যারামিটার ব্যবহার করে GRChg38 রেফারেন্স জিনোমে গণনা করুন, ফলন 1,408 ( PHAGE-ATAC), 5,654 (PHAGE-ASAP) এবং 4,806 (ASAP-seq) উচ্চ-মানের PBMC, যথাক্রমে (সেলরেঞ্জার-এটিএসি হাঁটু কলের বাইরে কোনও ফিল্টারিং প্রয়োগ করা হয়নি)। প্রতি-লাইব্রেরি ADTs9 এবং পিডিটিগুলি উপরে বর্ণিত প্রক্রিয়াকরণ পাইপলাইনগুলি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল৷ আমরা আরও ডাউনলোড করেছি প্রক্রিয়াকৃত CITE-seq PBMC ডেটা8 জিন এক্সপ্রেশন অমনিবাস থেকে (জিইও, অ্যাক্সিশন নম্বর GSE100866), যার ফলে স্পাইক-ইন মাউস সেল অপসারণের পরে 7,660 PBMC পুনরুদ্ধার করা হয়েছে। এই প্রকাশিত ডেটাসেটটি উপরে বর্ণিত নতুন উত্পন্ন ডেটাসেটের সাথে যৌথভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আমরা ক্যানোনিকাল পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ ব্যবহার করে ডেটা ইন্টিগ্রেশন করেছি 20 এবং 2,000টি সবচেয়ে পরিবর্তনশীল আরএনএ জিন সেউরাতের ডিফল্ট। এরপরে, আমরা ডিফল্ট সেটিংস Seurat v.3 ব্যবহার করে ATAC-seq ডেটার জন্য আরএনএ ইম্প্যুটেশন করেছি 33

। হ্রাসকৃত মাত্রা এবং সেল ক্লাস্টারগুলি Seurat v.3-তে ডিফল্ট লুভেন ক্লাস্টারিংয়ের সাথে প্রথম 25টি ক্যানোনিকাল পারস্পরিক সম্পর্ক উপাদানগুলির মাধ্যমে এই একত্রিত বস্তুটি ব্যবহার করে অনুমান করা হয়েছিল। কেন্দ্রীভূত লগ(অনুপাত) (সিএলআর)-সাধারণকৃত পিডিটিগুলিকে হ্রাসকৃত মাত্রার জায়গায় কল্পনা করা হয়েছিল এবং একটি প্রতি-ট্যাগ, প্রতি-ক্লাস্টার গড় গণনা করা হয়েছিল পদ্ধতিগুলির মধ্যে আরও অ্যাক্সেস স্টেনিং পারস্পরিক সম্পর্কের জন্য (চিত্র 2d

)।

সেল টীকাগুলি PBMC-এর জন্য সু-প্রতিষ্ঠিত মার্কার জিনের উপর ভিত্তি করে প্রাপ্ত হয়েছিল (বর্ধিত ডেটা চিত্র। 6h

)। প্রোটিন-ভিত্তিক ক্লাস্টারিং এবং বিশ্লেষণের জন্য, আমরা সমন্বিত এম্বেডিং (ক্রোমাটিন/আরএনএ ডেটা ব্যবহার করে) থেকে টি-সেল ক্লাস্টারগুলি সনাক্ত করেছি এবং তারপরে CD4 এবং CD8 PDT CLR (বর্ধিত ডেটা চিত্র)

6d,f)। এই জনসংখ্যার মধ্যে ডিফারেনশিয়াল জিন অ্যাক্টিভিটি স্কোরগুলি তখন সেউরাট/সিগন্যাক (উইলকক্সনের র‌্যাঙ্ক-সম পরীক্ষা) ডিফল্ট কার্যকারিতা ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল। প্রতিটি পদ্ধতির প্রোটিন পরিমাপের তুলনা করার জন্য, আমরা CD4 এবং CD8 T কোষগুলির লেবেলযুক্ত ক্লাস্টারগুলিকে ব্যবহার করেছি (শুধুমাত্র অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন এবং RNA প্রাচুর্যগুলি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছে) ইতিবাচক লেবেল হিসাবে এবং অন্যান্য কোষের প্রকারগুলিকে নেতিবাচক হিসাবে ব্যবহার করেছি (এইভাবে, লেবেলগুলি ক্লাস্টারিংয়ের একটি ফাংশন এবং অপূর্ণ)। এই প্রতি-কোষ ইতিবাচক এবং নেতিবাচক টীকা ব্যবহার করে, আমরা প্রতিটি পদ্ধতিতে প্রতিটি প্রোটিনের জন্য রিসিভার অপারেটিং বক্ররেখা নির্ধারণ করেছি (চিত্র 2e).

সোমাটিক এর উচ্চ মানের ক্যাপচার যাচাই করতে এই পরীক্ষায় mtDNA মিউটেশন, সিকোয়েন্সিং রিডগুলি chrM-এর সাথে সারিবদ্ধভাবে mgatk ব্যবহার করে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল, যেমনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে 11

। স্ট্যান্ডার্ড ভেরিয়েন্ট থ্রেশহোল্ড ব্যবহার করে কমপক্ষে একটি কক্ষে মোট 518টি উচ্চ-মানের বৈকল্পিক সনাক্ত করা হয়েছিল (ভেরিয়েন্স মানে অনুপাত>−2; স্ট্র্যান্ড পারস্পরিক সম্পর্ক> 0.65), এবং নিউক্লিওটাইড প্রতিস্থাপনের সমৃদ্ধকরণ স্ট্র্যান্ড-নির্দিষ্ট রূপান্তরের আমাদের পূর্বে চিহ্নিত প্যাটার্নের সাথে মিলেছে।

11

সেল হ্যাশিং এর বিশ্লেষণ PHAGE-ATAC পরীক্ষা

হ্যাশড, একত্রিত, CD8-সমৃদ্ধ T কোষ থেকে সিকোয়েন্সিং ডেটার একটি চ্যানেল GRCh38 এর মাধ্যমে CellRanger-ATAC গণনা ব্যবহার করে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল রেফারেন্স জিনোম এবং সমস্ত ডিফল্ট প্যারামিটার, ফলন 8,366 উচ্চ-কিউ uality PBMCs (কোন ফিল্টারিং CellRanger-ATAC হাঁটু কলের বাইরে প্রয়োগ করা হয়নি)। যেহেতু আমরা বি কোষকে দূষিত করার উপস্থিতি সন্দেহ করেছিলাম, আমরা প্রথমে সিগন্যাক এবং সিউরাট

ব্যবহার করে সুপ্ত শব্দার্থিক সূচক (LSI)-ভিত্তিক ক্লাস্টারিং এবং মাত্রা হ্রাস ব্যবহার করে কোষের অবস্থা চিহ্নিত করেছি। 33

। বিশেষত, সমস্ত সনাক্ত করা শিখরগুলি LSI-তে ইনপুট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রথম 20টি এলএসআই উপাদান (প্রথম উপাদানটি বাদে, যা প্রতি-কোষ সিকোয়েন্সিং গভীরতার সাথে সম্পর্কযুক্ত পাওয়া গেছে) সেউরাতে ডিফল্ট লুভেন ক্লাস্টারিং অ্যালগরিদম ব্যবহার করে সেল ক্লাস্টারগুলিকে সংজ্ঞায়িত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রতি-ক্লাস্টার ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটি ট্র্যাকগুলি প্রতিটি ক্লাস্টারের জন্য প্রতি- মিলিয়ন টুকরা প্রাচুর্য ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল, যেমনটি পূর্বে প্রয়োগ করা হয়েছিল

11

। এই ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটি ট্র্যাকগুলি পরিচিত মার্কার জিনের প্রোমোটার অ্যাক্সেসিবিলিটির উপর ভিত্তি করে সেল ক্লাস্টারগুলিকে টীকা করতে ব্যবহার করা হয়েছিল। সেউরাত

23

0.98 এ সেট করা পজিটিভ. কোয়ান্টাইল প্যারামিটার সহ। এটি CD8 হ্যাশট্যাগ PDTs-এর প্রাচুর্য এবং বিতরণের উপর ভিত্তি করে 703 ডাবলট, 1,225 নেগেটিভ এবং 6,438 সিঙ্গেল দিয়েছে। mgatk ব্যবহার করে mtDNA জিনোটাইপিং

11

, এবং স্যুপোরসেল ব্যবহার করে পারমাণবিক জিনোটাইপিং এবং দাতা নিয়োগ

24 ‘–min_alt 8 –min_ref 8 –no_umi True -k 4 –skip_remap True –ignore True’ বিকল্পগুলির সাথে, যার ফলে 92.9% নির্ভুলতা (99.3% সিঙ্গেল সঠিকতা, 74% ওভারল্যাপ বলা ডাবলটে), আমাদের হ্যাশিং ডিজাইনের সঙ্গতি নিশ্চিত করে।

PBMC-HEK293T মিশ্রণের PHAGE-ATAC পরীক্ষার বিশ্লেষণ

ডিফল্ট সেলরেঞ্জার-এটিএসি দ্বারা কম সেল হাঁটু কলের কারণে হাঁটু কল (সম্ভবত PBMCs এবং HEK293T কোষের মিশ্রণের কারণে), আমরা ম্যানুয়ালি উচ্চ আত্মবিশ্বাস কোষ সনাক্ত করেছি যেগুলির একটি TSS স্কোর> 4 ছিল এবং শিখরে অন্তত 500টি অ্যাক্সেসযোগ্য ক্রোমাটিন টুকরা রয়েছে, যার ফলে 4,690 কোষ পাওয়া যায়। LSI থেকে 2-30 উপাদান ব্যবহার করে, আমরা Signac এর সাথে একটি মাত্রিকতা হ্রাস এবং ক্লাস্টারিং তৈরি করেছি 33। লাইব্রেরিতে ব্যবহৃত সমস্ত ফেজগুলির জন্য উপরে বর্ণিত ক্যালিস্টো|বুস্টুলগুলি ব্যবহার করে পিডিটিগুলি পরিমাপ করা হয়েছিল৷

PANL-এর ক্লোনিং, একটি সিন্থেটিক হাই-কমপ্লেক্সিটি pNb লাইব্রেরি

এলোমেলো লাইব্রেরি সন্নিবেশ তৈরি করতে, তিনটি পৃথক প্রাইমার মিশ্রণ (দীর্ঘ CDR3, মাঝারি CDR3 এবং ছোট জন্য CDR3 সন্নিবেশ) পিসিআর-মধ্যস্থতা সমাবেশের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। সংক্ষিপ্ত CDR3 সন্নিবেশের জন্য, প্রাইমার মিশ্রণে প্রতিটি পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস-বিশুদ্ধ EF42, EF43, EF64, EF44, EF65, EF45, EF46, EF47, EF66 এবং EF48 (প্রতিটি 100Btechio) এর 0.5 μl থাকে। মাঝারি CDR3 সন্নিবেশের জন্য, EF66 এর পরিবর্তে EF67 ব্যবহার করা হয়েছিল। দীর্ঘ CDR3 সন্নিবেশের জন্য, EF66 এর পরিবর্তে EF68 ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রাইমার মিক্সগুলি 1:25 মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং ফিউশন (NEB) ব্যবহার করে ওভারল্যাপ-এক্সটেনশন PCR-এর জন্য প্রতিটি মিশ্রণের 1 μl ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রতিটি মিশ্রণের জন্য চারটি 50-μl প্রতিক্রিয়া নিম্নলিখিত সাইক্লিং শর্তগুলি ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল: 1 মিনিটের জন্য 98 °C; 15 সেকেন্ডের জন্য 98 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 20টি চক্র, 30 সেকেন্ডের জন্য 60 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 30 সেকেন্ডের জন্য 72 ডিগ্রি সেলসিয়াস; এবং 5 মিনিটের জন্য 72 °C এর চূড়ান্ত এক্সটেনশন। একই মিশ্রণের পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলিকে 280 μl এএমপিউর এক্সপি পুঁতি (বেকম্যান কুল্টার) যোগ করে পুল এবং বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। পুঁতিগুলিকে 800 μl 80% ইথানল দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং একত্রিত সন্নিবেশগুলি 100 μl জলে নির্গত করা হয়েছিল। প্রতিটি সন্নিবেশের ঘনত্ব (দীর্ঘ, মাঝারি, সংক্ষিপ্ত) নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং 1:2:1 মোলার অনুপাতের মধ্যে পুল করা হয়েছিল। পুল করা সন্নিবেশ এবং প্রাইমার EF40 এবং EF41 সহ পাঁচটি অভিন্ন 50-μl PCR প্রতিক্রিয়াগুলি নিম্নলিখিত সাইক্লিং শর্তগুলির সাথে Phusion (NEB) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল: 1 মিনিটের জন্য 98 °C; 15 সেকেন্ডের জন্য 98 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 30টি চক্র, 30 সেকেন্ডের জন্য 62 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 30 সেকেন্ডের জন্য 72 ডিগ্রি সেলসিয়াস; এবং 5 মিনিটের জন্য 72 °C এর চূড়ান্ত এক্সটেনশন। পরিবর্ধিত লাইব্রেরি সন্নিবেশটি 350 μl AMPure XP পুঁতি (বেকম্যান কুল্টার) যোগ করে পুল এবং বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। জপমালা 1 মিলি 80% ইথানল দিয়ে দুবার ধোয়া হয়েছিল এবং লাইব্রেরি সন্নিবেশটি 60 μl জলে বিলুপ্ত হয়েছিল। লাইব্রেরি ভেক্টর pDXinit-PAC এর 2.5 μl SapI সহ 7.5 µg ডাইজেস্টের জন্য পাঁচটি অভিন্ন 60-µl সীমাবদ্ধতা ডাইজেস্ট প্রতিক্রিয়া সঞ্চালিত হয়েছিল। লাইব্রেরি সন্নিবেশ (4.8 µg) 2.5 µl SapI ব্যবহার করে 30-µl প্রতিক্রিয়ায় হজম হয়েছিল। ডাইজেস্টগুলি 4 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং 1% অ্যাগারোজ জেলে লোড করা হয়েছিল। হজমকৃত লাইব্রেরি ভেক্টর এবং সন্নিবেশের সাথে সম্পর্কিত ব্যান্ডগুলি কাটা হয়েছিল এবং জিনজেট জেল এক্সট্রাকশন কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে পণ্যগুলি বের করা হয়েছিল এবং 40 μl জলে নির্গত করা হয়েছিল। পাঁচটি অভিন্ন 100-μl লাইগেশন প্রতিক্রিয়া সম্পাদিত হয়েছিল, যার প্রতিটিতে 1.25 μg হজমকৃত pDXinit-PAC, 450 ng হজম করা সন্নিবেশ এবং 0.5 μl T4 লিগেস (NEB) রয়েছে। লিগেশনগুলি 16 ঘন্টা 16 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউব করা হয়েছিল, 65 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 20 মিনিটের জন্য তাপ নিষ্ক্রিয় করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় শীতল করা হয়েছিল। তারপরে, প্রতিটি বন্ধন বিক্রিয়ায় 100 μl AMPure XP পুঁতি যুক্ত করা হয়েছিল, পুঁতিগুলি 80% ইথানলের 300 μl ব্যবহার করে দুবার ধোয়া হয়েছিল এবং 15 μl জলে লিগেশন পণ্যগুলিকে পুল করা হয়েছিল। 2-মিমি কিউভেটে (বায়োরাড) পাঁচটি ইলেক্ট্রোপোরেশন সঞ্চালিত হয়েছিল, প্রতিটিতে 90 μl ইলেক্ট্রোকম্পিটেন্ট SS320 ব্যবহার করে ই. কোলি (লুসিজেন) এবং 12 μl লিগেশন পণ্য। 2.5 kV, 200 Ω এবং 25 µF পরামিতি সহ একটি GenePulserXcell যন্ত্রে (BioRad) পালসিং করা হয়েছিল। ইলেক্ট্রোপোরেশনের পরে, ক্যাটাবোলাইট রিপ্রেশন (এসওসি) সহ 120 মিলি প্রি-ওয়ার্মড সুপার অপ্টিমাল ব্রোথে ব্যাকটেরিয়া সাসপেনশন যোগ করা হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 225 আরপিএম তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল এই সময়ে লাইব্রেরি বহনকারী ব্যাকটেরিয়াগুলির একটি অ্যালিকোট সংরক্ষণ করা হয়েছিল এবং এটি প্রস্তুত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। dilution সিরিজ। প্রতিটি পাতলা এলবি-অ্যাম্প প্লেটে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে রাতারাতি ইনকিউবেশনের পরে, উপনিবেশগুলি গণনা করা হয়েছিল, রূপান্তর দক্ষতা নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং গ্রন্থাগারের জটিলতা অনুমান করা হয়েছিল। অবশিষ্ট 120 মিলি লাইব্রেরি-ধারণকারী সংস্কৃতি 2% গ্লুকোজ ধারণকারী 2YT মাধ্যমের 1.125 l যোগ করা হয়েছে, 50 μg ml−1 এম্পিসিলিন এবং 10 µg মিলি−1 টেট্রাসাইক্লিন (2YT/2%/A/T) এবং 37 °C এবং 240 rpm-এ রাতারাতি ইনকিউবেট করা হয়েছিল লাইব্রেরি-ধারণকারী সংস্কৃতি সংগ্রহ করা হয়েছিল, গ্লিসারল স্টক প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং লাইব্রেরি অ্যালিকোটগুলি সংরক্ষণ করা হয়েছিল .

পিসিআর এবং সেঞ্জার সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে বাছাই করা প্যানএল ক্লোনগুলির বিশ্লেষণ

লাইব্রেরি-ধারণকারী ব্যাকটেরিয়া LB-Amp-এ প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল, রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল, এবং উপনিবেশগুলিকে 8 মিলি এলবি-অ্যাম্পে বাছাই করা হয়েছিল এবং টিকা দেওয়া হয়েছিল। 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় কমপক্ষে 8 ঘন্টার জন্য কালচারগুলিকে ইনকিউব করা হয়েছিল এবং 240 আরপিএম ব্যাকটেরিয়া সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং জিনজেট প্লাজমিড মিনিপ্রেপ কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে প্লাজমিডগুলিকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। ক্লোন সন্নিবেশ মূল্যায়ন করার জন্য পিসিআর করা হয়েছিল; 10-μl PCR প্রতিক্রিয়াগুলি সেট আপ করা হয়েছিল যাতে 10 ng বিচ্ছিন্ন প্লাজমিড, 0.5 μl প্রতিটি প্রাইমার EF52 এবং EF53 এবং 4.5 μl 2× OneTaq কুইক লোড মাস্টার মিক্স (NEB) ছিল। সাইক্লিং শর্ত ছিল: 4 মিনিটের জন্য 94 °C; 15 সেকেন্ডের জন্য 94 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 28টি চক্র, 15 সেকেন্ডের জন্য 62 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 30 সেকেন্ডের জন্য 68 ডিগ্রি সেলসিয়াস; এবং 5 মিনিটের জন্য 68 °C এ একটি চূড়ান্ত এক্সটেনশন। পিসিআর প্রতিক্রিয়া 2% অ্যাগারোজ জেলে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নির্বাচিত ক্লোনগুলি প্রাইমার EF17 ব্যবহার করে স্যাঞ্জার সিকোয়েন্সিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

ফেজ এনবি লাইব্রেরি উত্পাদন

3 × 10১০

এর সাথে সম্পর্কিত একটি PANL অ্যালিকোট ব্যাকটেরিয়া কোষ (গ্রন্থাগারের প্রায় 5× কভারেজ) 2YT/2%/A/T এর 200 মিলি-এ স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং OD

পর্যন্ত সংস্কৃতি বৃদ্ধি করা হয়েছিল 600=0.5 পৌঁছেছে (~2 ঘন্টা)। সংস্কৃতিগুলি 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 60 মিনিটের জন্য M13K07 হেল্পার (NEB) এর 8 মিলি দ্বারা সংক্রামিত হয়েছিল। তারপরে সেগুলি কাটা হয়েছিল, সুপারন্যাট্যান্টগুলি ফেলে দেওয়া হয়েছিল এবং 2YT/A/K এর 1 লিটার মধ্যে ব্যাকটেরিয়া ছুরিগুলি পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। পিএনবি কণার ইনপুট লাইব্রেরি তৈরির জন্য কালচারগুলিকে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 250 আরপিএম তাপমাত্রায় রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল। ব্যাকটেরিয়াল কালচার সংগ্রহ করা হয়েছিল, সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং পলি(ইথিলিন গ্লাইকোল)/NaCl ব্যবহার করে ফেজগুলি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে। চূড়ান্ত ফেজ পেলেটগুলি মোট 20 মিলি পিবিএসে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং সংরক্ষণ করা হয়েছিল। ফেজ টাইটারগুলি SS320-এর একটি লগ (ফেজ কালচার) সংক্রামিত করে উত্পাদিত ফেজ লাইব্রেরির একটি তরলীকরণ সিরিজ এবং LB-Amp-এ ব্যাকটেরিয়া প্লেটিং দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল। উপনিবেশগুলি গণনা করা হয়েছিল এবং টাইটারগুলি গণনা করা হয়েছিল। উত্পাদিত ফেজ লাইব্রেরিগুলি টাইটার দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল>4 × 10

11 প্ল্যাক-ফর্মিং ইউনিট (pfu) ml−1

ফেজ প্রদর্শন নির্বাচন

HEK293T কোষগুলি উপরে বর্ণিত হিসাবে 24 ঘন্টার জন্য pCAG বা pCAG-EGFP-GPI দিয়ে ক্ষণস্থায়ীভাবে স্থানান্তরিত হয়েছিল। কোষ সংগ্রহ করা হয়েছে, 107 pCAG- স্থানান্তরিত কোষগুলি পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছে 1 মিলি পিবিএসে 2% BSA (PBS–BSA) এবং PANL লাইব্রেরির 8 মিলি (1.6 × 1012 pfu) PBS–BSA-তে পাল্টা নির্বাচনের জন্য যোগ করা হয়েছে। নমুনাগুলি 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে একটি ঘূর্ণায়মান চাকায় 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল এবং তারপরে 350 g 4 °C তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য। 107 pCAG-EGFP-তে ফেজ ধারণকারী সুপারনেট্যান্ট যোগ করা হয়েছে ইতিবাচক নির্বাচনের জন্য GPI- প্রকাশকারী কোষ। 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ঘূর্ণায়মান চাকায় 1 ঘন্টা পরে, নমুনাগুলি সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল (350g, 5 মিনিট এবং 4 ডিগ্রি সেলসিয়াস) এবং আনবাউন্ড ফেজগুলি অপসারণ করতে PBS-BSA দিয়ে ছয়বার ধোয়া। কোষগুলি একবার পিবিএস-এ ধুয়ে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, এবং সেল পেলেটগুলি 500 μl ট্রিপসিন দ্রবণে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল (1 মিলিগ্রাম মিলি −1

পিবিএস-এ ট্রিপসিন (সিগমা-অলড্রিচ)) আবদ্ধ ফেজগুলি নির্মূল করতে। ঘরের তাপমাত্রায় একটি ঘূর্ণায়মান চাকায় 30 মিনিটের জন্য কোষগুলিকে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং AEBSF প্রোটিজ ইনহিবিটর (সিগমা-অলড্রিচ) 0.5 মিলিগ্রাম মিলি এর চূড়ান্ত ঘনত্বে যোগ করার মাধ্যমে হজম বন্ধ করা হয়েছিল। −1। নমুনাগুলি সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল (400g এবং ঘরের তাপমাত্রায় 4 মিনিট) এবং 10 মিলি লগ (ফেজ SS320) (OD

সংক্রামিত করতে ইলুটেড ফেজ ধারণকারী সুপারনাট্যান্ট ব্যবহার করা হয়েছিল 600

=০.৪ ) 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 40 মিনিটের জন্য সংক্রমণের পরে, 2YT/2%/A/T এর 90 মিলিলিটারে সংস্কৃতি যোগ করা হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 250 rpm-এ আউটপুট লাইব্রেরি সমন্বিত সংস্কৃতিগুলিকে রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল এবং গ্লিসারোল স্টক প্রস্তুত করা হয়েছিল। আউটপুট লাইব্রেরি ফেজ কণাগুলি PANL-এর জন্য পূর্বে বর্ণিত হিসাবে প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং এখানে বর্ণিত একই প্রোটোকল ব্যবহার করে পরবর্তী নির্বাচন রাউন্ডগুলিতে ব্যবহৃত হয়েছিল৷

PANL এবং সিলেকশন আউটপুট লাইব্রেরির সিকোয়েন্সিং

ব্যাকটেরিয়াল কালচারের আশ্রয়ে ফেজেমিড লাইব্রেরি 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে রাতারাতি জন্মায় এবং 2% গ্লুকোজ এবং 50 µg ml−1 অ্যাম্পিসিলিন। ZymoPURE II প্লাজমিড মিডিপ্রেপ কিট (জাইমো রিসার্চ) ব্যবহার করে ব্যাকটেরিয়া সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং প্লাজমিডগুলিকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। Nb সন্নিবেশগুলিকে প্রশস্ত করার জন্য একটি প্রথম পিসিআর সঞ্চালিত হয়েছিল; 100-μl PCR প্রতিক্রিয়াগুলি সেট আপ করা হয়েছিল যাতে 100 ng বিচ্ছিন্ন প্লাজমিড লাইব্রেরি, 2.5 μl প্রাইমার মিক্স EF235–EF241 এবং 2.5 μl মিক্স EF249–EF255, এবং 50 μl এর 2.50 μl 2.50 μl রিডফাইক্স হোআর্ট (ReadFixtkArt)। সাইকেল চালানোর শর্ত ছিল: 3 মিনিটের জন্য 95 °সে; 20 সেকেন্ডের জন্য 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 16টি চক্র, 30 সেকেন্ডের জন্য 60 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 20 সেকেন্ডের জন্য 72 ডিগ্রি সেলসিয়াস; এবং 5 মিনিটের জন্য 72 °C এর চূড়ান্ত এক্সটেনশন। Nb amplicons 120 μl SPRIselect পুঁতি (Beckman Coulter) যোগ করে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল, পুঁতিগুলি 200 μl 80% ইথানল দিয়ে দুবার ধোয়া হয়েছিল এবং Nb প্রোডাক্ট লাইব্রেরিগুলি 40 μl বাফার EB (QIAGEN) এ বিকৃত করা হয়েছিল।

অ্যামপ্লিকন লাইব্রেরির ঘনত্ব নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং 20 ng 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche), 2.5 μl প্রাইমার EF242 এবং 25 μl ব্যবহার করে 100-μl ইন্ডেক্সিং PCR প্রতিক্রিয়াগুলির জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রাইমার EF256 এর μl; সাইকেল চালানোর অবস্থা ছিল: 45 সেকেন্ডের জন্য 95 °সে; 20 সেকেন্ডের জন্য 95 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 6টি চক্র, 30 সেকেন্ডের জন্য 67 °সে এবং 20 সেকেন্ডের জন্য 72 °সে; এবং 1 মিনিটের জন্য 72 °C এর চূড়ান্ত এক্সটেনশন। সূচীযুক্ত অ্যামপ্লিকন লাইব্রেরিগুলিকে 120 μl SPRIselect যোগ করে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল এবং 40 μl বাফার EB-তে বিকৃত করা হয়েছিল৷ চূড়ান্ত লাইব্রেরিগুলির ঘনত্ব একটি Qubit dsDNA HS Assay kit (Invitrogen) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং একটি Bioanalyzer 2100 সিস্টেমে (Agilent) একটি উচ্চ সংবেদনশীলতা ডিএনএ চিপ চালিয়ে আকার বিতরণ পরীক্ষা করা হয়েছিল। একটি MiSeq সিকোয়েন্সারে (Illumina)

অ্যামপ্লিকন লাইব্রেরিগুলিকে পুল করা হয়েছিল এবং পেয়ার-এন্ড সিকোয়েন্স করা হয়েছিল (পড়ুন 1: 96 সাইকেল, পড়ুন 2: 184 সাইকেল) ফেজমিড লাইব্রেরি সিকোয়েন্সিং পরীক্ষা-নিরীক্ষার বিশ্লেষণ

কাস্টমাইজড পাইথন কোড (‘process_phage_library_construct. py’) PANL লাইব্রেরি ডিজাইনের ধ্রুবক অঞ্চলের সাথে সম্পর্কিত একটি অবস্থানগত ক্রম লজিক ব্যবহার করে পরিবর্তনশীল CDR1, CDR2 এবং CDR3 সিকোয়েন্সগুলিকে পার্স করার জন্য লেখা হয়েছিল। সিকোয়েন্সিং পড়ে যেখানে ধ্রুবক অঞ্চলগুলি চিহ্নিত করা যায়নি (দুটি অমিল পর্যন্ত) বাতিল করা হয়েছিল, উল্লেখ্য যে সমস্ত লাইব্রেরিতে কমপক্ষে 90% পার্সিং দক্ষতা (পরিসীমা: 90-94%) ছিল। ল্যান্ডার-ওয়াটারম্যান পদ্ধতি

34

। একটি স্ট্যান্ডার্ড কোডন অভিধান ব্যবহার করে নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্সগুলিকে অ্যামিনো অ্যাসিড সিকোয়েন্সে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। ক্লোনগুলিকে টীকা দেওয়ার ক্ষেত্রে সিকোয়েন্সিং ত্রুটির জন্য অ্যাকাউন্ট করার জন্য, আমরা সিকোয়েন্সের ক্রমক্রমের উপর ভিত্তি করে ক্লোনগুলি নির্ধারণ করেছি এবং 2 এর হ্যামিং দূরত্বের মধ্যে যেকোন সিকোয়েন্সিংকে ভেঙে দিয়েছি (ভেরিয়েবল CDR1, CDR2 এবং CDR3 সিকোয়েন্সের নিউক্লিওটাইড পরিচয়ের উপর ভিত্তি করে)। প্রতি-পজিশন অ্যামিনো অ্যাসিড ফ্রিকোয়েন্সিগুলি শীর্ষ 1,000 ধসে পড়া ক্লোন ব্যবহার করে অনুমান করা হয়েছিল৷

রিপোর্টিং সারাংশ

গবেষণা নকশা সম্পর্কে আরও তথ্য পাওয়া যায়

প্রকৃতি গবেষণা প্রতিবেদনের সারাংশ

এই নিবন্ধের সাথে লিঙ্ক করা হয়েছে।

ডেটা উপলভ্যতা

এই কাজের সাথে যুক্ত ডেটা জিও অ্যাকসেশান নম্বরে পাওয়া যায়।

  • GSE157486
      উৎস তথ্য

    এই কাগজের সাথে সরবরাহ করা হয়েছে।

  • কোড উপলব্ধতা

    এই কাজের সাথে যুক্ত কাস্টম বিশ্লেষণ এবং পরিসংখ্যান পুনরুত্পাদন করার কোড

    https://github.com/evgenijfiskin/phage-atac

    রেফারেন্স

    1.

    ক্লেইন, এএম এট আল। একক-কোষ ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্সের জন্য ড্রপলেট বারকোডিং ভ্রূণের স্টেম সেলগুলিতে প্রয়োগ করা হয়। সেল 161 , 1187–1201 (2015)।

    CAS

    প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    2. Lareau, CA et al. বৃহদাকার-স্কেল একক-কোষ ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটির জন্য ফোঁটা-ভিত্তিক কম্বিনেটরিয়াল ইনডেক্সিং। ন্যাট। বায়োটেকনোল। 37, 916–924 (2019)।

    CAS প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    3.

    ম্যাকোস্কো, ইজেড এবং অন্যান্য। ন্যানোলিটার ফোঁটা ব্যবহার করে পৃথক কোষের উচ্চ সমান্তরাল জিনোম-ওয়াইড এক্সপ্রেশন প্রোফাইলিং। সেল 161 , 1202–1214 (2015)।

    CAS প্রবন্ধ

    গুগল পণ্ডিত

    4.

    সতপথি, এটি এট আল। মানুষের ইমিউন সেল ডেভেলপমেন্ট এবং ইন্ট্রাটুমোরাল টি সেল নিঃসরণের ব্যাপক সমান্তরাল একক-কোষ ক্রোমাটিন ল্যান্ডস্কেপ। ন্যাট। বায়োটেকনোল। 37, 925-936 (2019)।

    CAS

    প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    ৫.

    মা, এ., ম্যাকডারমেইড, এ. , Xu, J., Chang, Y. & Ma, Q. একক-কোষ মাল্টি-ওমিক্সের জন্য একীভূত পদ্ধতি এবং ব্যবহারিক চ্যালেঞ্জ। ট্রেন্ডস বায়োটেকনোল। 38, 1007–1022 (2020)।

    CAS প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    6.

    মিমিটু, ইপি এবং অন্যান্য। একক কোষে প্রোটিন, ট্রান্সক্রিপ্টোম, ক্লোনোটাইপ এবং CRISPR বিভ্রান্তির মাল্টিপ্লেক্স সনাক্তকরণ। ন্যাট। পদ্ধতি

    16, 409 –412 (2019)।

    CAS

    প্রবন্ধ

    গুগল পণ্ডিত

    7.পিটারসন, ভিএম এবং অন্যান্য। একক কোষে প্রোটিন এবং ট্রান্সক্রিপ্টের মাল্টিপ্লেক্সড কোয়ান্টিফিকেশন। ন্যাট। বায়োটেকনোল। ৩৫, 936–939 (2017)।

    CAS

    প্রবন্ধ

    গুগল পণ্ডিত ৮.

    স্টোকিয়াস, এম. এট আল। একক কোষে যুগপত এপিটোপ এবং ট্রান্সক্রিপ্টোম পরিমাপ। ন্যাট। পদ্ধতি

    14, 865 –868 (2017)।

    CAS নিবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    9.

    মিমিটু, ইপি এবং অন্যান্য। একক কোষে ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটি, জিন এক্সপ্রেশন এবং প্রোটিনের মাত্রার মাল্টিমোডাল প্রোফাইলিং। ন্যাট। বায়োটেকনোল। 39, 1246–1258 (2021)।

    CAS

    প্রবন্ধ

    গুগল পণ্ডিত

    10. সোয়ানসন, ই. এবং অন্যান্য। TEA-seq ব্যবহার করে ট্রান্সক্রিপ্ট, এপিটোপস এবং ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটির যুগপত ট্রাইমোডাল একক-কোষ পরিমাপ। ইলাইফ

    10 , (2021)।

    ১১.

    লারেউ, সিএ এবং অন্যান্য। ব্যাপকভাবে সমান্তরাল একক-কোষ মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ জিনোটাইপিং এবং ক্রোমাটিন প্রোফাইলিং। ন্যাট। বায়োটেকনোল। 39, 451–461 (2021)।12.

    লুডউইগ, এলএস এট আল। মাইটোকন্ড্রিয়াল মিউটেশন এবং একক-কোষ জিনোমিক্স দ্বারা সক্ষম মানুষের মধ্যে বংশের সন্ধান। সেল

    176 , 1325–1339 e1322 (2019)।

    CAS প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    13. স্মিথ, জিপি ফিলামেন্টাস ফিউশন ফেজ: অভিনব এক্সপ্রেশন ভেক্টর যা ভিরিয়ন পৃষ্ঠে ক্লোন করা অ্যান্টিজেন প্রদর্শন করে। বিজ্ঞান 228 , 1315–1317 (1985)।

    CAS প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    14.

    Hoogenboom, HR নির্বাচন এবং রিকম্বিন্যান্ট অ্যান্টিবডি লাইব্রেরি স্ক্রীনিং। ন্যাট। বায়োটেকনোল। 23, 1105–1116 (2005)।

    CAS

    প্রবন্ধ গুগল এস কলর 15.

    ইনগ্রাম, জেআর, শ্মিট, FI & Ploegh, HL ন্যানোবডির একক বৈশিষ্ট্য শোষণ করছে। আন্নু। রেভ. ইমিউনল। 36, 695–715 (2018)।

    CAS প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    16.

    Katz enelenbogen, Y. et al. যুগল scRNA-seq এবং অন্তঃকোষীয় প্রোটিন কার্যকলাপ ক্যান্সারে TREM2 এর একটি ইমিউনোসপ্রেসিভ ভূমিকা প্রকাশ করে। সেল

    182 , 872–885 e819 (2020)।

    CAS

    প্রবন্ধ

    গুগল পণ্ডিত

    17.পল, এফ. এট আল। ট্রান্সক্রিপশনাল ভিন্নতা এবং মাইলয়েড প্রোজেনিটারে বংশের প্রতিশ্রুতি। সেল

    163 , 1663–1677 (2015)।

    CAS প্রবন্ধ

    গুগল পণ্ডিত

    ১৮ . পোলক, এসবি এবং অন্যান্য। জেনেটিক্যালি বারকোডেড অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে উচ্চ মাল্টিপ্লেক্সড এবং পরিমাণগত সেল-সারফেস প্রোটিন প্রোফাইলিং। Proc. Natl Acad. বিজ্ঞান আমেরিকা 115, ২৮৩৬ –2841 (2018)।

    CAS প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    19.

    Rothbauer, U. et al. ফ্লুরোসেন্ট ন্যানোবডি সহ লাইভ কোষে অ্যান্টিজেনকে লক্ষ্য করা এবং ট্রেসিং করা। ন্যাট। পদ্ধতি

    3, 887 –889 (2006)।

    CAS প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    ২০.

    বাটলার, এ. ., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E. & Satija, R. ইন্টিগ্রেটিং একক-কোষ ট্রান্সক্রিপ্টোমিক বিভিন্ন অবস্থা, প্রযুক্তি এবং প্রজাতি জুড়ে ডেটা। ন্যাট। বায়োটেকনোল। 36, 411–420 (2018)।

    CAS প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    21. গেহরিং, জে., হুই পার্ক, জে., চেন, এস., থমসন, এম. অ্যান্ড প্যাচটার, এল. হাইলি সেলুলার প্রোটিনের ডিএনএ অলিগোনিউক্লিওটাইড ট্যাগিং দ্বারা মাল্টিপ্লেক্সড একক-কোষ RNA-seq। ন্যাট। বায়োটেকনোল। 38, 35–38 (2020)।

    CAS প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    22.ম্যাকগিনিস, সিএস এবং অন্যান্য। মাল্টি-সেক: লিপিড-ট্যাগযুক্ত সূচকগুলি ব্যবহার করে একক-কোষ আরএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য নমুনা মাল্টিপ্লেক্সিং। ন্যাট। পদ্ধতি

    16, 619 –626 (2019)।

    CAS নিবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    23.

    স্টোইকিয়াস, এম. এট আল। বারকোডেড অ্যান্টিবডি সহ সেল হ্যাশিং একক কোষের জিনোমিক্সের জন্য মাল্টিপ্লেক্সিং এবং ডাবল সনাক্তকরণ সক্ষম করে। জিনোম বায়োল।

    19, 224 (2018)।

    CAS

    প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    24.

    Heaton, H. et al. Souporcell: রেফারেন্স জিনোটাইপ ছাড়া জিনোটাইপ দ্বারা একক-কোষ RNA-seq ডেটার শক্তিশালী ক্লাস্টারিং। ন্যাট। পদ্ধতি

    17, 615 –620 (2020)।

    CAS

    প্রবন্ধ গুগল পণ্ডিত

    25.

    Bradbury, AR, Sidhu, S., Dubel, S. & McCafferty, J. প্রাকৃতিক অ্যান্টিবডির বাইরে: ভিট্রো প্রদর্শন প্রযুক্তির শক্তি। ন্যাট। বায়োটেকনোল। ২৯, 245-254 (2011)।

    CAS প্রবন্ধ গুগল স্কলার

    26.

    মিয়ারশ, এস. ও সিধু, এসএস সিন্থ টিক অ্যান্টিবডি: ধারণা, সম্ভাব্য এবং ব্যবহারিক বিবেচনা।

    27.Dai, L. & Gao, GF ভাইরাল লক্ষ্য COVID-19 এর বিরুদ্ধে ভ্যাকসিনের জন্য।

    CAS প্রবন্ধ গুগল স্কলার

    ২৮.

    রেবোল্ড, এমআইজে, কোভাল্টসুক, A., Marks, C. & Deane, CM CoV-AbDab: করোনভাইরাস অ্যান্টিবডি ডেটাবেস।

    ২৯.

    ওয়াকার, এমএ এবং অন্যান্য। মানুষের টি কোষে প্যাথোজেনিক মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএর বিরুদ্ধে বিশুদ্ধকরণ নির্বাচন।

    এন। ইংরেজি জে. মেড. 383figure1, 1556–1563 (2020)।

    প্রবন্ধ

    গুগল স্কলার

    30.

    Gebauer, M. & Skerra, A. পরবর্তী প্রজন্মের অ্যান্টিবডি থেরাপিউটিক হিসাবে ইঞ্জিনিয়ারড প্রোটিন স্ক্যাফোল্ডস।

    কার। মতামত কেম। Biol. 13, 245–255 (2009).

    CAS প্রবন্ধ

    গুগল স্কলার

    31.

    Geertsma, ER এবং Dutzler, R. একটি বহুমুখী এবং দক্ষ এনটি স্ট্রাকচারাল বায়োলজির জন্য হাই-থ্রুপুট ক্লোনিং টুল। বায়োকেমিস্ট্রি 50 , 3272–3278 (2011)।

    CAS প্রবন্ধ

    গুগল পণ্ডিত

    32.

    ম্যাকমোহন, সি. এট আল। গঠনগতভাবে নির্বাচনী ন্যানোবডিগুলির দ্রুত আবিষ্কারের জন্য খামির পৃষ্ঠ প্রদর্শন প্ল্যাটফর্ম। ন্যাট। গঠন. মোল. Biol. 25, 289–296 (2018)।

    CAS

    প্রবন্ধ

    গুগল পণ্ডিত

    33.

    স্টুয়ার্ট, T. et al. একক-কোষ ডেটার ব্যাপক ইন্টিগ্রেশন। সেল 177 , 1888–1902 e1821 (2019)।

  • ল্যান্ডার, ইএস এবং ওয়াটারম্যান, এমএস জিনোমিক ম্যাপিং আঙ্গুলের ছাপ র্যান্ডম ক্লোন দ্বারা: একটি গাণিতিক বিশ্লেষণ। জিনোমিক্স 2 , 231–239 (1988)।

  • CAS
  • প্রবন্ধ
  • গুগল পণ্ডিত
  • 35.

  • Kubala, MH, Kovtun, O., Alexandrov, K. & Collins, BM GFP এর স্ট্রাকচারাল এবং থার্মোডাইনামিক বিশ্লেষণ: GFP–ন্যানোবডি কমপ্লেক্স। প্রোটিন বিজ্ঞান
  • 19, 2389–2401 (2010)।

  • CAS
  • নিবন্ধ
  • গুগল পণ্ডিত
    রেফারেন্স ডাউনলোড করুন

  • স্বীকারনামা

    চিত্রের চিত্র এবং প্রস্তুতিতে সহায়তার জন্য আমরা এল. গ্যাফনিকে ধন্যবাদ জানাই এবং সি. ডি বোয়ের এবং অন্যান্য সহায়ক আলোচনার জন্য রেগেভ পরীক্ষাগারের সদস্যরা। আমরা তাদের সহায়তার জন্য ব্রড ইনস্টিটিউট ফ্লো সাইটোমেট্রি কোর সুবিধাকে ধন্যবাদ জানাই। এই গবেষণাটি NHGRI অনুদান (নম্বর 5RM1 HG006193) (সেন্টার ফর সেল সার্কিট), ফুড অ্যালার্জি সায়েন্স ইনিশিয়েটিভের একটি উপহার, মানটন ফাউন্ডেশন এবং HHMI (এআরকে) থেকে একটি উপহার দ্বারা সমর্থিত ছিল। EF একটি EMBO দীর্ঘমেয়াদী ফেলোশিপ দ্বারা সমর্থিত। CAL একটি স্ট্যানফোর্ড সায়েন্স ফেলোশিপ দ্বারা সমর্থিত। LSL জার্মান রিসার্চ ফাউন্ডেশনের (LU 2336/2-1) একটি এমি নোথার ফেলোশিপ দ্বারা সমর্থিত। AMR লুডভিগ ফ্যামিলি ফাউন্ডেশন থেকে একটি উপহার দ্বারা সমর্থিত ছিল। AR একজন হাওয়ার্ড হিউজেস মেডিকেল ইনস্টিটিউটের তদন্তকারী ছিলেন (৩১ জুলাই ২০২০ পর্যন্ত)।

    লেখকের তথ্য

    লেখক নোট

    আভিভ রেগেভ

    বর্তমান ঠিকানা: জেনেনটেক, সাউথ সান ফ্রান্সিসকো, CA , আমেরিকা

    অধিভুক্তি

    ক্লারম্যান সেল অবজারভেটরি, ব্রড ইনস্টিটিউট অফ হার্ভার্ড এবং এমআইটি, কেমব্রিজ, এমএ, ইউএসএ

    ইভজেনিজ ফিস্কিন, লেইফ এস লুডভিগ, গোকেন ইরাসলান, রামনিক জে. জেভিয়ার এবং আভিভ রেগেভ

    প্যাথলজি বিভাগ, স্ট্যানফোর্ড বিশ্ববিদ্যালয়, স্ট্যানফোর্ড, CA, USA

    C আলেব এ. লারেউ

    ফার্মাকোলজি বিভাগ, ইয়েল স্কুল অফ মেডিসিন, নিউ হ্যাভেন, সিটি, ইউএসএ

    অ্যারন এম. রিং

    আণবিক জীববিজ্ঞান বিভাগ, ম্যাসাচুসেটস জেনারেল হাসপাতাল এবং হার্ভার্ড মেডিকেল স্কুল, বোস্টন , MA, USA

    রামনিক জে. জেভিয়ার

    Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA, USA

    রামনিক জে. জেভিয়ার

    হাওয়ার্ড হিউজ মেডিকেল ইনস্টিটিউট, জীববিজ্ঞান বিভাগ, ম্যাসাচুসেটস ইনস্টিটিউট অফ টেকনোলজি, কেমব্রিজ, এমএ, ইউএসএ

    আভিভ রেগেভ

    অবদানসমূহ

    EF পরিকল্পিত এবং পরিকল্পিত AREF-এর নির্দেশনা নিয়ে প্রজেক্টটি ডিজাইন করেছে এবং পরীক্ষা-নিরীক্ষা করেছে। EF CALEF থেকে ইনপুট নিয়ে PHAGE-ATAC কম্পিউটেশনাল ওয়ার্কফ্লো তৈরি করেছে, LSLEF এবং C থেকে ইনপুট নিয়ে PHAGE-ATAC পরীক্ষামূলক প্রোটোকল তৈরি করেছে .AL তথ্য বিশ্লেষণ. জিই ডেটা বিশ্লেষণে অবদান রেখেছে। FL এবং AMR নির্বাচিত CEACAM4 Nb এবং বৈধ CEACAM4 Nb. AR এবং RJX প্রকল্পের তদারকি প্রদান করেছে। AR তহবিল অর্জিত. EF এবং AR সকল লেখকের কাছ থেকে ইনপুট নিয়ে পাণ্ডুলিপি লিখেছেন।

    সংশ্লিষ্ট লেখক

    অতিরিক্ত তথ্য

    পিয়ার রিভিউ তথ্য প্রকৃতি জৈবপ্রযুক্তি ধন্যবাদ অ্যান্ড্রু অ্যাডে, ড্যান জি এবং অন্য, বেনামী, পর্যালোচক(দের) পিয়ার রিভিউতে তাদের অবদানের জন্য এই কাজ.

    প্রকাশকের নোট স্প্রিংগার প্রকৃতি প্রকাশিত মানচিত্র এবং প্রাতিষ্ঠানিক অধিভুক্তির ক্ষেত্রে এখতিয়ারগত দাবির বিষয়ে নিরপেক্ষ থাকে৷

    সম্প্রসারিত ডেটা

    বর্ধিত ডেটা চিত্র 1 বারকোডিং কৌশলগুলি PHAGE-ATAC বনাম এপিটোপ পরিমাণ নির্ধারণের জন্য। CITE-seq.

    a, PHAGE-ATAC-এর জন্য ন্যানোবডি-প্রদর্শক ফেজ। একটি নির্দিষ্ট ফেজ কণার মধ্যে থাকা ফেজমিড সেই একই ফেজে প্রদর্শিত প্রোটিনকে এনকোড করে এবং PHAGE-ATAC প্রতিটি ফেজের জন্য অনন্য জেনেটিক বারকোড শনাক্তকারী হিসাবে হাইপারভেরিয়েবল ন্যানোবডি CDR3 সিকোয়েন্সগুলিকে লিভারেজ করে। b, অলিগোনিউক্লিওটাইড-কনজুগেটেড অ্যান্টিবডি CITE-seq. প্রতিটি অ্যান্টিবডি আলাদাভাবে একটি অনন্য ডিএনএ-বারকোড দিয়ে সংযুক্ত করা হয়। c, জেল জপমালা অলিগোসের পরিকল্পিত ইলুমিনা P5 সিকোয়েন্স (P5), এলোমেলো গুটিকা বারকোড (BC) এবং RD1-এর সাথে সংকরকরণের জন্য ব্যবহৃত RD1-এর প্রথম 14 bp-এর সাথে Tn5-প্রাপ্ত ক্রোমাটিন টুকরা এবং ইঞ্জিনিয়ারড PHAGE-ATAC ফেজমিড দেখানো হচ্ছে। d, ন্যানোবডি-এনকোডিং ফাজেমিড কনস্ট্রাক্ট 10x জিনোমিক্স প্রাইমার দ্বারা RD1-মধ্যস্থিত CDR3 বারকোড ক্যাপচারের জন্য। উপরের স্ট্র্যান্ড হল কোডিং স্ট্র্যান্ড। ওরিয়েন্টেশন (তীর এবং ছায়াযুক্ত বাক্স), নিউক্লিওটাইড ক্রম এবং RD1-ধারণকারী নির্মাণগুলির অনুবাদ পণ্য দেখানো হয়েছে। ন্যানোবডি-পি3 রিডিং ফ্রেমে RD1 প্রবর্তনের মাধ্যমে স্টপ কোডন তৈরি না করার জন্য RD1 জুড়ে রিডিং ফ্রেম বজায় রাখার জন্য অতিরিক্ত কোডনগুলি প্রবর্তন করা হয়, এইভাবে PAC ট্যাগ প্রতিষ্ঠা করা হয়। e, আগারোজ জেল দুই পরে- ধাপ পিসিআর 10x ATAC প্রাইমার ব্যবহার করে রৈখিক পরিবর্ধন নিয়ে গঠিত এবং তারপরে P5 এবং ইলুমিনা রিড 2 (RD2) ব্যবহার করে এক্সপোনেনশিয়াল পিসিআর – ন্যানোবডি-নির্দিষ্ট প্রাইমার ধারণকারী। PDTs শুধুমাত্র PAC-ট্যাগযুক্ত phagemids-এর জন্য প্রাপ্ত হয়েছিল RD1 সহ নন-কোডিং স্ট্র্যান্ডে অবস্থিত (ন্যানোবডির সাথে সম্পর্কিত 3′-5′ অভিযোজন)। সংক্ষিপ্ত রূপ c। ন্যানোবডি সিকোয়েন্সের মধ্যে হাইব্রিডাইজ করা দুটি প্রাইমার ব্যবহার করে কন্ট্রোল পিসিআর করা হয়েছিল পদ্ধতি)। তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে একটি প্রতিনিধি জেল চিত্র দেখানো হয়েছে। f

    , পোস্ট বারকোডিং ধাপের পরিকল্পিত ATAC এবং PDT সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরির প্রজন্মের জন্য পদ্ধতি)। ইমালশন ভাঙ্গার পরে, বারকোডেড লিনিয়ার অ্যামপ্লিফিকেশন পণ্যগুলি শুদ্ধ করা হয় এবং নমুনাগুলি বিভক্ত করা হয়। ATAC ফ্র্যাগমেন্ট লাইব্রেরিগুলি অবিলম্বে নমুনা সূচক পিসিআরের জন্য প্রক্রিয়া করা হয়। পিডিটি লাইব্রেরিগুলি প্রথমে একটি পিডিটি-নির্দিষ্ট পিসিআর-এ একটি CDR3 ফ্ল্যাঙ্কিং ধ্রুবক ন্যানোবডি সিকোয়েন্স পিসিআর হ্যান্ডেল হিসাবে ব্যবহার করে প্রশস্ত করা হয়। PDT পরিবর্ধন চূড়ান্ত নমুনা সূচীকরণের জন্য প্রয়োজনীয় RD2 অ্যাডাপ্টার পরিচিতির অনুমতি দেয়। P5 এবং P7, Illumina P5 এবং P7 অনুক্রম nces CBC, এলোমেলো 10x পুঁতি সেল বারকোড। i7, নমুনা সূচক।

    সূত্র ডেটা

    বর্ধিত ডেটা চিত্র 2 অ্যান্টি-EGFP ন্যানোবডি-প্রদর্শন ফেজগুলির মাধ্যমে ঝিল্লি-স্থানীয় EGFP সনাক্তকরণ এবং ফিক্সেশন এবং লাইসিস অবস্থার অপ্টিমাইজেশন।

    a, b, ঝিল্লি EGFP প্রকাশ করেছে। a, পৃষ্ঠ-উন্মোচিত পরিকল্পনা GPI-অ্যাঙ্কর করা EGFP। b, HEK293T কোষের মাইক্রোস্কোপি ছবি নির্দেশিত গঠন প্রকাশ করা, ট্যাগবিহীন সাইটোসোলিক EGFP (pCAG-EGFP, মধ্যম) এবং GPI-অ্যাঙ্করড মেমব্রেন-স্থানীয় EGFP (pCAG-EGFP-GPI, ডান, এর ডিফারেনশিয়াল স্থানীয়করণ দেখানো পদ্ধতি), ৪টি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে একটি প্রতিনিধি মাইক্রোগ্রাফ দেখানো হয়েছে। c, সনাক্তকরণের জন্য পরিকল্পিত ফ্লো সাইটোমেট্রির মাধ্যমে ফেজ। ফেজ-দাগযুক্ত কোষগুলি মাউসের অ্যান্টি-এম 13 কোট প্রোটিন অ্যান্টিবডিগুলির সাথে ইনকিউবেট করা হয় এবং তারপরে অ্যালেক্সা ফ্লুর 647-কঞ্জুগেটেড অ্যান্টি-মাউস সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দ্বারা সনাক্ত করা হয়। ফেজ বাইন্ডিং এইভাবে অ্যালেক্সা ফ্লুর 647 সংকেত দ্বারা প্রতিফলিত হয়। d, অ্যান্টির ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ -EGFP ফেজ ন্যানোবডি EGFP-প্রকাশকারী HEK293T কোষে আবদ্ধ। EGFP ফ্লুরোসেন্স (y অক্ষ) এবং ফেজ বাঁধাই এক্স অক্ষ, Alexa Fluor 647) প্রতিটি HEK293T কোষের জনসংখ্যাতে b, হয় দাগমুক্ত (বাম) অথবা একটি অ্যান্টি-EGFP ফেজ (ডান) দিয়ে দাগযুক্ত। EGFP-প্রকাশকারী কোষগুলি সর্বদা EGFP হাই উভয়ের উপস্থিতি দ্বারা চিহ্নিত করা হয় এবং EGFPlo জনসংখ্যা। e, সনাক্তকরণের নির্দিষ্টতা। যেমন d কিন্তু নির্দেশিত ব্যবহার করে মেমব্রেন-EGFP-প্রকাশকারী কোষগুলির নির্দিষ্ট দাগের জন্য স্টেইনিং নিয়ন্ত্রণ। f,g, PAC-ট্যাগ ন্যানোবডি প্রদর্শন এবং অ্যান্টিজেন মিথস্ক্রিয়াকে প্রভাবিত করে না। EGFP ফ্লুরোসেন্স (f, y অক্ষ) এবং ফেজ বাইন্ডিং f, এক্স অক্ষ, আলেক্সা ফ্লুর 647) এবং ফেজ বাইন্ডিং এর স্তরের বিতরণ g) নির্দেশিত ফেজ ন্যানোবডি ব্যবহার করে ফেজ-দাগযুক্ত EGFP-GPI কোষ প্রকাশের জন্য (RD1 ক্রমগুলির জন্য বর্ধিত ডেটা চিত্র দেখুন।

    1d)। h,i, EGFP ফ্লুরোসেন্স ( h, y

    অক্ষ) এবং ফেজ বাইন্ডিং h,

    এক্স অক্ষ, Alexa Fluor 647) এবং ফেজ বাইন্ডিং প্রতিফলিত হিস্টোগ্রাম i) EGFP-GPI এক্সপ্রেসিং সেলগুলির জন্য PAC-ট্যাগযুক্ত অ্যান্টি-EGFP-Nb দ্বারা দাগযুক্ত ফিক্সেশন এবং ব্যাপ্তিকরণ শর্তগুলি ব্যবহার করে ফেজগুলি প্রদর্শন করে৷

    Verify currency and authenticity via CrossMark

    , ভগ্নাংশ y

    অক্ষ) এবং সংখ্যা এক্স অক্ষ, লগ10

    স্কেল) জনসংখ্যা (রঙের কিংবদন্তি) দ্বারা রঙিন প্রতিটি বারকোড (ডট) এর জন্য ওভারল্যাপিং পিকগুলির অনন্য ক্রোমাটিন টুকরা। c,d, ভগ্নাংশের বণ্টন অনন্য ATAC টুকরা ওভারল্যাপিং শিখরগুলির c, y অক্ষ) বা TSS d, y অক্ষ) তিনটি কোষের জনসংখ্যার প্রতিটিতে এক্স অক্ষ,, মানুষের EGFP+ কোষ n=580, মানুষের EGFP- কোষ n=578, মাউস কোষ n=1,212 একটি পরীক্ষা থেকে) (ম্যান-হুইটনি টু-টেইলড, p −4, NS=উল্লেখযোগ্য নয়, c মানব ইজিএফপি+ বনাম মানব ইজিএফপি- পি=2.155 × 10 −10, মানুষের EGFP- বনাম মাউস p=5.367 × 10−239, মানুষের EGFP + বনাম মাউস p=1.711 ×10−225, ইন

    d মানব ইজিএফপি + বনাম মানব ইজিএফপি- পি=3.311 × 10 −12, মানুষের EGFP- বনাম মাউস p=7.008 × 10−26, মানুষের EGFP + বনাম মাউস p=6.099 ×10−77)। লাইন: মধ্যমা। e,f

    , আন্তঃকোষীয় সনাক্তকরণ PHAGE-ATAC. e, অ্যান্টির ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ -ইজিএফপি ফেজ ন্যানোবডি সাইটোসোলিক ইজিএফপি-প্রকাশকারী HEK293T কোষের সাথে আবদ্ধ। EGFP ফ্লুরোসেন্স (y অক্ষ) এবং ফেজ বাঁধাই এক্স অক্ষ, অ্যালেক্সা ফ্লুর 647) হয় অপরিবর্তিত কোষে (বামে) বা কোষে ফিক্সেশন এবং লাইসিস (ডানদিকে) পদ্ধতি), উভয়ই এন্টি-EGFP pNb দিয়ে ইনকিউব করা হয়। সাইটোসোলিক EGFP-প্রকাশকারী কোষগুলি সর্বদা EGFP হাই উভয়ের উপস্থিতি দ্বারা চিহ্নিত করা হয়) এবং EGFPlo জনসংখ্যা। f, PDT পরিমাপের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ প্রবাহ সাইটোমেট্রি ফলাফল। সাইটোসোলিক EGFP ফ্লুরোসেন্স ডিস্ট্রিবিউশন (বাম, এক্স অক্ষ) এবং EGFP PDT এর বিতরণ (ডানে, এক্স

    অক্ষ) সাইটোসোলিক ইজিএফপি + (হালকা নীল) এবং EGFP (গাঢ় নীল) HEK293T কোষ।

      বর্ধিত ডেটা চিত্র 4 PHAGE-ATAC ব্যবহার করে ফিক্সেশন এবং লাইসিস অবস্থার অপ্টিমাইজেশন PBMCs.

    a, নির্দেশিত অবস্থার অধীনে PBMC-তে জেনারেট করা অ্যান্টি-CD4 ফেজ ন্যানোবডিগুলির আবদ্ধতা। দুটি ভিন্ন ফর্মালডিহাইড ঘনত্ব (0.1% বা 1%) পাশাপাশি নির্দেশিত লাইসিস শর্তগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল। ফেজ বাইন্ডিং অ্যালেক্সা ফ্লুর 647 ফ্লুরোসেন্ট সংকেত তীব্রতা দ্বারা প্রতিফলিত হয়। b

    , ডেটার হিস্টোগ্রাম a। ce, এর গুণমান মেট্রিক্সের তুলনা ATAC লাইব্রেরি বিভিন্ন ফিক্সেশন এবং lysis অবস্থার অধীনে. DNase অতি সংবেদনশীল সাইটগুলিতে খণ্ডের ভগ্নাংশের বিতরণ c, y অক্ষ), ATAC লাইব্রেরির আকার d, y অক্ষ) বা খণ্ড ভগ্নাংশ ওভারল্যাপিং TSS , y অক্ষ) প্রতিটি কোষের বারকোডের জন্য 0.1% ফর্মালডিহাইড ফিক্সেশন এবং ATAC লাইসিস বনাম। 1% ফর্মালডিহাইড ফিক্সেশন এবং 0.1% NP-40 lysis এক্স অক্ষ, 0.1% ফিক্সেশন সেল n=2,153, 1% ফিক্সেশন সেল n=1,408, প্রতিটি একটি পরীক্ষা থেকে)। f, mtDNA এর দক্ষ ক্যাপচার প্রয়োজন অপ্টিমাইজড ফিক্সেশন এবং লাইসিস শর্ত। mtDNA- থেকে প্রাপ্ত খণ্ডের ভগ্নাংশের বিতরণ
    y অক্ষ) প্রতিটি সেল বারকোডের জন্য 0.1% ফর্মালডিহাইড ফিক্সেশন এবং ATAC লাইসিস বনাম। 1% ফর্মালডিহাইড ফিক্সেশন এবং 0.1% NP-40 lysis এক্স অক্ষ)। gj
    , PBMC- আবদ্ধ সনাক্তকরণ PHAGE-ATAC-তে phages অপ্টিমাইজ করা ফিক্সেশন এবং lysis অবস্থার দ্বারা সক্রিয় করা হয়েছে। ক্রমবর্ধমান বিতরণ gj, y অক্ষ) CD4-এ CD4 PDTs+ টি কোষ (g, এক্স অক্ষ) বা মনোসাইট h, এক্স অক্ষ) এবং CD16 তে CD16 PDTs+ মনোসাইট i, এক্স অক্ষ) বা NK কোষ j, এক্স অক্ষ) 0.1% ফর্মালডিহাইড ফিক্সেশন এবং ATAC লাইসিস ব্যবহার করে কোষ প্রক্রিয়াকরণের পরে PHAGE-ATAC ডেটাতে বনাম। 1% ফর্মালডিহাইড ফিক্সেশন এবং 0.1% NP-40 lysis। এর জন্য বক্সপ্লট cf: কেন্দ্র লাইন, মধ্যমা; বাক্সের সীমা, প্রথম এবং তৃতীয় চতুর্থাংশ; কাঁটা, 1.5× ইন্টারকোয়ার্টাইল রেঞ্জ।

    a, বিশ্লেষিত ফেজ-দাগযুক্ত পিবিএমসিগুলির জন্য ফ্লো সাইটোমেট্রি গেটিং কৌশল। bc

    , ফ্লো সাইটোমেট্রি-ভিত্তিক বাঁধাই গেটেড লিম্ফোসাইট থেকে নির্দেশিত পৃষ্ঠ চিহ্নিতকারী-স্বীকৃত ফেজ ন্যানোবডিগুলির মূল্যায়ন b, CD4+ টি কোষ , CD8+ টি কোষ, CD16+ NK কোষ) এবং মনোসাইট c, CD4

    + এবং CEACAM4+) জনসংখ্যা, অ্যান্টি-EGFP pNb নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। d, এন্টি CEACAM4 এর বিশ্লেষণ ন্যানোবডি বিশুদ্ধ CEACAM4 এর সাথে আবদ্ধ। বিশুদ্ধ CEACAM4 y অক্ষ, অপটিক্যাল ঘনত্ব 450nm-570nm) ন্যানোবডি এর বিভিন্ন ঘনত্ব জুড়ে এক্স অক্ষ), বিশুদ্ধ বিএসএ নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল . e, এর সাথে দাগযুক্ত PBMC-এর তুলনা একটি ভাল বৈশিষ্ট্যযুক্ত অ্যান্টি-সিডি 4 অ্যান্টিবডি বা জেনারেট করা অ্যান্টি-সিডি 4 ফেজ ন্যানোবডি। ফেজ বাইন্ডিং অ্যালেক্সা ফ্লুর 647 ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যাল তীব্রতা দ্বারা প্রতিফলিত হয়।

    বর্ধিত ডেটা চিত্র 6 PHAGE-এর বেঞ্চমার্কিং ATAC, PHAGE-ASAP, ASAP-seq এবং CITE-seq মানুষের PBMCs প্রোফাইলিংয়ের জন্য।

    ac , বিভিন্ন অ্যাসেস জুড়ে ATAC মানের মেট্রিক্সের তুলনা। DNase অতি সংবেদনশীল সাইটগুলিতে খণ্ড ভগ্নাংশ a, y অক্ষ), ATAC লাইব্রেরির আকার b, y অক্ষ) বা টুকরো ভগ্নাংশ ওভারল্যাপিং TSS c, y অক্ষ) প্রতিটি সেল বারকোডের জন্য PHAGE-ATAC (কোষ n=1,408), ASAP-seq (কোষ n=4,806) ) অথবা PHAGE-ASAP (কোষ n=5,654) ডেটা এক্স অক্ষ, একটি পরীক্ষা)। d, প্রোটিন স্তর পরিমাপের চুক্তি PHAGE-ATAC এবং CITE-seq-এ। PDT (বাম, PHAGE-ATAC) বা ADT (ডানে, CITE-seq8) CD8 এর গণনা (CLR রূপান্তরিত) y অক্ষ) এবং CD4 এক্স প্রতিটি কক্ষে (বিন্দু), sc-ATAC থেকে প্রাপ্ত সেল টাইপ টীকা দ্বারা রঙিন -seq (PHAGE-ATAC) বা scRNA-seq (CITE-seq) প্রোফাইল ভিত্তিক ক্লাস্টারিং (চিত্রের মতো) 2c)। CITE-seq ডেটাতে সেল বারকোডগুলিকে PHAGE-ATAC পরীক্ষার সাথে মেলানোর জন্য ডাউন নমুনা দেওয়া হয়েছিল। e, CD4 PDT পরিমাপ সামঞ্জস্যপূর্ণ প্রবাহ সাইটোমেট্রি সহ। বিতরণ ই, y

    অক্ষ) এর CD4 PDT গণনা (CLR রূপান্তরিত) ই (বামে), এক্স

    অক্ষ) বা অ্যান্টি-CD4 ফেজ বাইন্ডিং (ডানদিকে), Alexa Fluor 647 ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যাল, এক্স অক্ষ) CD4 এ +

    টি কোষ, CD8 + টি কোষ এবং মনোসাইট। f,g, PDT এবং ADT CD4+ এবং CD8

    এর গণনা-ভিত্তিক শ্রেণীবিভাগ + টি কোষ। f, গড় লগ 2

    (পরিবর্তন ভাঁজ) (এক্স অক্ষ) এবং তাৎপর্য ( y অক্ষ, -লগ10

    (P-মান)) পিডিটি-শ্রেণীবদ্ধ CD4 তুলনা করে প্রতিটি জিন কার্যকলাপ স্কোরের জন্য + এবং CD8+ PHAGE-ATAC টি কোষ পদ্ধতি)। সত্যবাদী মার্কারগুলি লেবেলযুক্ত। g, AUROC বক্ররেখা সংবেদনশীলতা ( y অক্ষ) এবং নির্দিষ্টতা এক্স অক্ষ) CD4+

    এর জন্য (বামে) এবং CD8+ (ডানদিকে) পিডিটি (PHAGE-ATAC এবং PHAGE-ASAP) বা ADTs (ASAP-seq এবং CITE-seq) পদ্ধতি)। h, PHAGE দ্বারা ক্যাপচার করা বিভিন্ন পদ্ধতি – যত তাড়াতাড়ি সম্ভব। PBMCs-এর PHAGE-ASAP scATAC-seq ডেটার 2D এম্বেডিং, প্রোটিন ADTs বা PDTs দ্বারা রঙিন (বাম), স্বাভাবিককৃত জিন কার্যকলাপ স্কোর (মধ্যম) বা mtDNA মিউটেশন হেটেরোপ্লাজমি (ডানে)। i, mtDNA এর তুলনামূলক ক্যাপচার। mtDNA থেকে প্রাপ্ত ফ্র্যাগমেন্ট ভগ্নাংশের বিতরণ y অক্ষ) প্রতিটি সেল বারকোডের জন্য PHAGE-ATAC, ASAP-seq বা PHAGE-ASAP এক্স অক্ষ, সেল নম্বর যেমন ac)। j, 518 এর জন্য নিউক্লিওটাইড প্রতিস্থাপন হার mgatk নামক মিউটেশন y অক্ষ) মনো- এবং ট্রিনিউক্লিওটাইড পরিবর্তনের প্রতিটি গ্রুপ জুড়ে এক্স অক্ষ) ভারী (H) এবং হালকা স্ট্র্যান্ডে (L) mtDNA (রঙ)। এর জন্য বক্সপ্লট a, খ, c এবং i: কেন্দ্র রেখা, মধ্যমা ; বাক্সের সীমা, প্রথম এবং তৃতীয় চতুর্থাংশ; কাঁটা, 1.5× ইন্টারকোয়ার্টাইল রেঞ্জ।

    বর্ধিত ডেটা চিত্র 7 হ্যাশট্যাগ ফেজ ব্যবহার করে নমুনা মাল্টিপ্লেক্সিং।a, বৈধতা ফেজ হ্যাশট্যাগ বাঁধাই. অ্যান্টি-CD8 হ্যাশট্যাগ ফেজ বাউন্ডের ফ্লো সাইটোমেট্রি (Alexa Fluor 647 ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যাল, এক্স অক্ষ) ফেজ-দাগযুক্ত PBMC-এর ফ্লো সাইটোমেট্রির মাধ্যমে গেটেড লিম্ফোসাইট থেকে (যেমন বর্ধিত ডেটা চিত্রে দেখানো হয়েছে। 5a)। b
    , সেলের ধরন সনাক্তকরণ। হ্যাশড CD8+ টি কোষের দ্বি-মাত্রিক এম্বেডিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছে PHAGE-ATAC, সেল টাইপ টীকা দ্বারা রঙিন। c, সিউডোবাল্ক ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসিবিলিটি ট্র্যাক প্লট জন্য CD8, CD3 এবং MS4A1 CD20) চিহ্নিত কোষের ধরন জুড়ে অবস্থান। d, এম্বেড করা খ CD8 হ্যাশট্যাগ PDT দ্বারা রঙিন কক্ষ সহ। e,f, সর্বোচ্চ বিতরণ CD8 PDT ঘনত্ব e, y অক্ষ) বা অনন্য ক্রোমাটিন টুকরা f, y অক্ষ) প্রতিটি সেল বারকোডের জন্য CD8 (B সেল 1 এবং B সেল 2) এবং CD8+ (নন-বি সেল) সেল এক্স অক্ষ, CD8 সেল n=137, CD8+ কোষ n=8,229, একটি পরীক্ষা থেকে) ( মান-হুইটনি টু-টেইলড, p −4, ভিতরে e পি=3.138 ×10−57, ইন f p=2.171 ×10−33)। g, হ্যাশট্যাগ-ভিত্তিক মধ্যে সমন্বয় বারকোডের শ্রেণীবিভাগ এবং চিহ্নিত mtDNA SNPs। হ্যাশট্যাগ অ্যাসাইনমেন্ট (উল্লম্ব শীর্ষ রঙের বার) দ্বারা লেবেলযুক্ত প্রতিটি কক্ষে (কলাম) বিভিন্ন mtDNA রূপের (সারি) হেটেরোপ্লাজমি (অ্যালিল ফ্রিকোয়েন্সি শতাংশ; রঙ বার)

    বর্ধিত ডেটা চিত্র 8 PANL প্রতিষ্ঠা, একটি সম্পূর্ণ সিন্থেটিক উচ্চ-জটিলতা PAC-ট্যাগযুক্ত ফেজ ন্যানোবডি লাইব্রেরি।

    a, PANL লাইব্রেরির পরিকল্পিত ডিজাইন এবং লাইব্রেরি ফাগেমিড। PANL-এ CDR3 সিকোয়েন্স ডাইভারসিফিকেশন এবং ন্যানোবডি ফ্রেমওয়ার্ক (ধূসর) পূর্বে রিপোর্ট করা ন্যানোবডি র্যান্ডমাইজেশন কৌশল এর উপর ভিত্তি করে 32। হোয়াইট বক্স: প্রতিটি হাইপারভেরিয়েবল অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের প্রত্যাশিত ফ্রিকোয়েন্সি (এক্স দ্বারা চিহ্নিত), লাইব্রেরি জেনারেশনের জন্য একটি কাস্টম এলোমেলো প্রাইমার মিশ্রণ ব্যবহার করে সামঞ্জস্য করা হয়েছে পদ্ধতি )। CDR3 লুপগুলিতে 7, 11 বা 15টি হাইপারভেরিয়েবল পজিশন থাকে, যার ফলে মোট CDR3 দৈর্ঘ্য 10 (ছোট), 14 (মাঝারি) বা 18 (দীর্ঘ) অ্যামিনো অ্যাসিড হয়। আংশিকভাবে এলোমেলো অবস্থানগুলিকে কলাম হিসাবে চিত্রিত করা হয়, ধ্রুবক অবস্থানে একটি একক অ্যামিনো অ্যাসিড থাকে। অ্যান্টি-EGFP Nb এর একটি জমা করা কাঠামো (PDB: 3ogo35

    ) রঙিন CDR3 লুপ সহ দেখানো হয়েছে। PANL phagemid চিত্রে দেখানো একটির সাথে সাদৃশ্যপূর্ণ। 1a। b, ফেজমিড সন্নিবেশের পরিবর্ধন পণ্য – 25টি এলোমেলোভাবে বাছাই করা PANL ক্লোনগুলির জন্য চিত্রিত প্রাইমার ব্যবহার করে পিসিআর প্রতিক্রিয়া ছড়িয়ে দেওয়া। দীর্ঘ, মাঝারি বা সংক্ষিপ্ত CDR3 উপস্থিতির কারণে পণ্যের আকার দেখানো হয়েছে। c, নির্বাচিত ক্লোনগুলির CDR3 ক্রম থেকে b সেঙ্গার সিকোয়েন্সিং দ্বারা প্রাপ্ত, CDR3 দৈর্ঘ্য নির্দেশিত, PANL লাইব্রেরিতে নন-এলোমেলো ধ্রুবক অবস্থান। d, অ্যামিনো অ্যাসিড ফ্রিকোয়েন্সি হিসাবে প্রকাশ করা হয় বিট (y অক্ষ) প্রতিটি সিডিআর অবস্থানে এক্স অক্ষ) PANL এর সিকোয়েন্সিং দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছে, দীর্ঘ CDR3 এর মানগুলি প্রতিনিধিত্বমূলকভাবে দেখানো হয়েছে। e, প্রত্যাশিত (ধূসর) এবং পর্যবেক্ষণ করা (লাল) ফ্রিকোয়েন্সি এক্স অক্ষ) হাইপারভারিয়েবল অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের y অক্ষ) পদ্ধতি

    )

    এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 9 ফেজ ডিসপ্লে নির্বাচন অ্যান্টিজেন-নির্দিষ্ট ন্যানোবডি-প্রদর্শনকারী ফেজ ক্লোন।

    ab, ইনপুট এবং আউটপুট ফেজ লাইব্রেরির সিকোয়েন্সিং দ্বারা নির্বাচন প্রক্রিয়ার বিশ্লেষণ। a, দীর্ঘ, মাঝারি শতাংশের শতাংশ এবং সংক্ষিপ্ত CDR3-যুক্ত pNb ক্লোন (শীর্ষ) বা PANL-এর মধ্যে পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের Nb সিকোয়েন্স (নীচে) এবং প্রতিটি নির্বাচন রাউন্ডের পরে আউটপুট লাইব্রেরি। b

    , কম্পাঙ্কের পার্থক্য ( চূড়ান্ত নির্বাচন আউটপুট (রাউন্ড 3) এবং PANL এর মধ্যে প্রতিটি সিডিআর অবস্থানে (কলাম) অ্যামিনো অ্যাসিডের (সারি) রঙ। c,d, ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ EGFP-GPI এক্সপ্রেসিং কোষে বাঁধার জন্য রাউন্ড 3 ফেজ ন্যানোবডি ক্লোন (EGFPhi এবং EGFPlo জনসংখ্যা লক্ষ্য করা যায় ) হয় শক্তিশালী
    c) বা দুর্বল (d) বাইন্ডার। এমচেরির বিরুদ্ধে ফেজ ন্যানোবডিগুলি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। ফেজ বাইন্ডিং অ্যালেক্সা ফ্লুর 647 সংকেত দ্বারা প্রতিফলিত হয়। e, CDR ক্রম এবং CDR3 দৈর্ঘ্য সেঞ্জার সিকোয়েন্সিং দ্বারা প্রাপ্ত নির্বাচিত ক্লোনগুলির। *PANL লাইব্রেরিতে নন-এলোমেলো ধ্রুবক অবস্থান (যেমন বর্ধিত ডেটা চিত্রে।

    8a)f, শতাংশ y

    অক্ষ, ইলুমিনা সিকোয়েন্সিং দ্বারা) প্রবাহ সাইটোমেট্রি যাচাইকৃত ক্লোন (থেকে e, রঙ) PANL-এ এবং প্রতিটি নির্বাচন রাউন্ডের পরে আউটপুট লাইব্রেরি (এছাড়াও চিত্র দেখুন। 4c).

    বর্ধিত ডেটা চিত্র 10 জেনারেশন, স্ক্রীনিং এবং অ্যান্টি-SARS-CoV এর ব্যবহার মাল্টিপ্লেক্স PHAGE-ATAC-এর জন্য -2-S pNbs এবং PANL-প্রাপ্ত pNbs।

    a, 28টি অ্যান্টি-SARS-এর ফ্লো সাইটোমেট্রি স্ক্রীনিং -CoV-2-S ফেজ ন্যানোবডি SARS-CoV-2-S প্রকাশকারী কোষের সাথে আবদ্ধ হওয়ার জন্য ক্লোন করে। ফেজ বাইন্ডিং সিগন্যাল বিতরণ (Alexa Fluor 647, y অক্ষ) SARS-CoV-2-S+ HEK239T কোষ (লাল) এবং খালি ভেক্টর (নীল) দিয়ে HEK239T নিয়ন্ত্রণ করুন। সাইড প্যানেল: নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত CD4 এর বিরুদ্ধে ফেজ ন্যানোবডি। b, সার্স-বিরোধী সনাক্তকরণ PHAGE-ATAC দ্বারা CoV-2-S বাঁধাই। PDT গণনার বিতরণ y অক্ষ) প্রতিটি অ্যান্টি-SARS-CoV2-S (S_) এবং অ্যান্টি-EGFP ফেজ (G_) ন্যানোবডির জন্য একক কোষে এক্স অক্ষ, বিশ্লেষণ কোষ n=4,690, একটি পরীক্ষা থেকে)। বক্সপ্লট: কেন্দ্র রেখা, মধ্যমা; বাক্সের সীমা, প্রথম এবং তৃতীয় চতুর্থাংশ; কাঁটা, 1.5× ইন্টারকোয়ার্টাইল রেঞ্জ। cg, যথাযথভাবে পারস্পরিক একচেটিয়া সনাক্তকরণ কোষের ধরন। c, PHAGE-এর 2D এম্বেডিং- PBMC এবং HEK293T কোষের মিশ্রণের ATAC scATAC-seq ডেটা (এছাড়া চিত্র দেখুন। 4c) , স্বাভাবিককৃত জিন কার্যকলাপ স্কোর (বাম) বা পরিমাপিত এপিটোপ পিডিটি (ডান) স্তর দ্বারা রঙিন। dg, PDT গণনা y এবং এক্স অক্ষ) pNbs এর জোড়া থেকে সমস্ত কোষ জুড়ে স্বতন্ত্র অ্যান্টিজেন শনাক্ত করে (বিন্দু রঙিন হিসাবে নির্দেশিত g এবং চিত্র figure44c) pNbs এন্টি-CD4 এর জন্য d, এক্স অক্ষ) এবং অ্যান্টি-SARS-CoV-2-S (S_6) d, y অক্ষ) বা অ্যান্টি-CD4 e, এক্স অক্ষ) এবং অ্যান্টি-EGFP (ক্লোন C5) ই, y অক্ষ) বা বিরোধী- CD16 (f, এক্স

    অক্ষ) এবং অ্যান্টি-EGFP (ক্লোন C5) f, y অক্ষ) বা অ্যান্টি-CD4 g , এক্স

    অক্ষ ) এবং অ্যান্টি-CD8 g , y অক্ষ)। উপরে বাম: পিয়ারসনের আর.

    সম্পূরক তথ্য

    এই নিবন্ধটি সম্পর্কে

    এই নিবন্ধটি উদ্ধৃত করুন

    ফিস্কিন, ই., লারেউ, সিএ, লুডভিগ, এলএস

    ইত্যাদি।

    PHAGE-ATAC ব্যবহার করে প্রোটিনের একক-কোষ প্রোফাইলিং এবং ক্রোমাটিন অ্যাক্সেসযোগ্যতা। ন্যাট বায়োটেকনোল

    (2021)। https://doi.org/10.1038/s41587-021-01065-5

    উদ্ধৃতি ডাউনলোড করুন

    DOI

    :

    https://doi.org/10.1038/s41587-021-01065-5

    আরো পড়ুন

    ট্যাগ

    কমেন্ট করুন

    Click here to post a comment